银杏（Ginkgo biloba L.）原产我国，系侏罗纪的孑遗植物，别名“活化石”。银杏的叶、果、树皮均有一定的药理作用，其中叶的药用价值最高。银杏叶提取物主要含有黄酮类和银杏内酯类，银杏黄酮在提取物中的含量较高其中所含有的黄酮能够增加脑血管流量，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高机体免疫能力。对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人均十分有益。以银杏叶提取物为主要成分多种制剂已广泛应用于临床。因此银杏叶黄酮的安全、优化的提取具有实际应用意义。
提取制备方法较常见的有煎煮法、溶剂萃取法和CO2超临界流体萃取法等。煎煮法直接加热容易破坏黄酮结构，溶剂萃取法耗费大量溶剂，对环境污染较高，CO2超临界流体萃取法对设备要求较高。本研究主要以黄酮含量作为指标，利用正交设计考察微波法提取的最佳工艺条件，并对初提物进一步通过大孔树脂分离纯化，考察其最佳纯化条件。
1 实验材料、试剂及仪器
1.1 材料与试剂
银杏叶，D101型大孔树脂、AB-8 型大孔树脂、HPD400型大孔树脂。
芦丁标准品（批号：100080-200306中国药品生物制品鉴定所），5%亚硝酸钠、1%氢氧化铝、4%氢氧化钠、50%乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液。
1.2 仪器和设备
DG 120型四两装中药材粉碎机（浙江省瑞安市春海药材器械厂）、M700型微波炉（广东美的微波炉制造有限公司）、GL-21M型高速冷冻离心机（长沙湘麓仪器有限公司）、YP202N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、722型紫外可见分光光度计（上海光谱仪有限公司）。
2 实验方法
2.1 芦丁的标准曲线
精密称取一定量的芦丁标准品，加60%乙醇制成0.2 mg/mL标准品溶液。准确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL芦丁标准溶液，放入已标好号的1～6号10 mL容量瓶内，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的60%乙醇溶液；再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 ml摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，放置6 min后；加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15 min；在510 nm处测定吸光度。用1号容量瓶作为空白，用芦丁浓度作为横坐标、吸光度作为纵坐标绘制标准曲线。
2.2 银杏叶黄酮的提取工艺的优化
2.2.1 银杏叶中总黄酮的提取工艺流程
市售干燥的银杏叶用粉碎机粉碎。精密称取1 g的银杏叶粉末于烧杯中，加入一定体积的60%乙醇，在微波低火档处理一定时间，提取1～3次，纱布粗过滤后，6000 rpm离心15 min，上清液减压抽滤，即得银杏叶提取液。
2.2.2 提取液中黄酮含量的测定
精密量取上清液1 mL，加至25 mL容量瓶中，再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 ml摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.5 ml，放置6 min后；加入4%氢氧化钠溶液4.0 ml，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15 min；定容至刻度，510 nm测定吸光度，带入回归方程求得黄酮浓度。按照以下公式计算总黄酮提取率：
银杏叶总黄酮含量=浓度（mg/ml）×稀释倍数×提取液体积（ml）×10-3/原料干重（g）。
2.3 大孔树脂分离纯化银杏叶黄酮
2.3.1 大孔树脂的预处理
将大孔树脂用乙醇浸泡24 h，倒去上层乙醇然后装柱，洗至流出液加水不呈白色浑浊为止，以去除树脂中所含有的低聚物、添加剂等杂质。
2.3.2 大孔树脂的静态吸附实验
2.3.2.1 大孔树脂类型的选择
大孔树脂在黄酮的分离纯化中应用较多，而树脂的厂家和型号众多，本实验选取较常用的三种大孔树脂D101型、AB-8型和HPD400型，分别考察其比吸附量和解吸率。
2.3.2.2 比吸附量的考察
分别取按2.3.1方法预处理好的三种大孔树脂1g置50 mL带塞锥形瓶中，精密称取银杏叶初提液20 mL，在振荡器中震荡24 h，待其饱和后测得其比吸附量。
P=（Cm-Cn）V/W
其中，P为比吸附量（mg/g），Co为起始质量浓度（1 g/L），Ct为上清液的质量浓度（1 g/L），V为溶液体积（mL），W为树脂质量（g）。
2.3.2.3 大孔树脂解吸率的测定
按2.3.2.2的方法将充分吸附后的树脂加入70%乙醇30 mL振荡器中震荡12 h后，过滤，精密量取2 mL滤液测定黄酮含量，按如下公式计算解吸率。
解析率=洗脱液总黄酮浓度×洗脱液体积/（比吸附量×树脂质量）
2.3.3 大孔树脂纯化银杏黄酮的工艺考察
2.3.3.1 乙醇洗脱浓度的考察
取银杏提取液8 mL，共分成4份，分别加入到装有10 g大孔树脂的层析柱中，吸附流速为2倍柱体积/h，再以两倍柱体积/h的水洗脱，弃去水洗液，然后分别以60%、70%、80%、90%乙醇洗脱，分别收集乙醇洗脱液至200 mL，合并乙醇洗脱液，测定吸光度，计算总黄酮含量及解吸率。精密吸取洗脱液50 mL，旋转蒸发器浓缩后，真空干燥箱中充分干燥，得干浸膏质量。计算干浸膏中黄酮含量。
2.3.3.2 洗脱剂流速的考察
取银杏提取液6 mL，共分成3份，分别加入到装有10g大孔树脂的层析柱中，吸附流速分别为1倍柱体积/h、2倍柱体积/h、3倍柱体积/h，再以两倍柱体积/h的水洗脱，弃去水洗液，然后以80%乙醇洗脱，分别收集乙醇洗脱液至200 mL，合并乙醇洗脱液，测定吸光度，计算解吸率。
2.3.3.3 洗脱剂用量的考察
取银杏提取液8 mL，共分成4份，分别加入到装有10 g大孔树脂的层析柱中，吸附流速为2倍柱体积/h，再以两倍柱体积/h的水洗脱，弃去水洗液，然后以80%乙醇洗脱，每隔3 min对流出液检验，至没有黄酮反应为止，记录乙醇用量。
2.3.4 大孔树脂洗脱液中黄酮的含量测定及得率计算
精密吸取洗脱液200 mL，旋转蒸发仪初步干燥，然后置于真空干燥箱中充分干燥，得干浸膏质量。称取一定量少量干浸膏，无水乙醇溶解，测定其中黄酮含量，以求得干浸膏中黄酮含量。
3 实验结果
3.1 芦丁的标准曲线
在510 nm下测定溶液的吸光度，以不同浓度芦丁溶液为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（如图1），线性方程为y=10.435x，R2=0.9993。
3.2 银杏叶黄酮提取的正交试验结果
根据前期单因素实验结果，确定影响总黄酮提取效率的4个主要因素：溶剂浓度（A）、料 液比（B）、提取次数（C）、提取时间（D），因素水平表见表1，进行L9（34）的正交试验。
由表2可知：1）直观分析结果表明，各因素极差值的高低影响银杏叶中黄酮提取工艺因素大小依次为乙醇浓度>料液比>提取次数>提取时间，最佳工艺条件为A2B2C2D1，即乙醇浓度60%、料液比1：30、提取2次、每次提取时间3 min。在此条件下再进行验证试验，平均得率2.161%。在最佳工艺下提取银杏叶黄酮用于后续纯化，计算结果如下：
提取液中黄酮含量=样品浓度×样品体积×稀释倍数=0.4325 g；
干浸膏重量=2.532 g
干浸膏中黄酮含量=提取液中黄酮含量/干浸膏重量×100%=17.08%
3.3 大孔树脂最佳纯化工艺的考察
3.3.1 大孔树脂的静态吸附实验
3.3.1.1比吸附量的考察
三种大孔树脂对银杏黄酮的比吸附量见表3。
3.3.1.2 大孔树脂解析率的测定
3种大孔树脂对银杏黄酮的解析率见表4。
由表3和表4可知，三种大孔树脂对银杏黄酮的比吸附量D101型﹥HPD400型﹥AB-8型，对银杏黄酮的解析率D101型﹥HPD400型﹥AB-8型，因此在三种树脂中选定D101型大孔树脂作为纯化银杏叶中黄酮的树脂，考察乙醇洗脱浓度、洗脱速率、洗脱剂用量等因素对黄酮纯化的影响。
3.3.2 大孔树脂纯化银杏黄酮的工艺条件考察
3.3.2.1 乙醇洗脱浓度的考察
由表5可知，随着乙醇浓度的升高，黄酮收率略增加，但增加不明显，但解吸率和产物浓度是80%乙醇最好，因此选择80%乙醇作为洗脱剂。
3.3.2.2 洗脱剂流速的考察
由表6可知，洗脱剂的过柱速度主要影响工作效率和黄酮的吸附率。流速增加黄酮的吸附量下降，结合实验效率选择2BV/h合适。
3.3.2.3 洗脱剂用量的考察
以80%乙醇洗脱，每隔3 min对流出液检验，至没有黄酮反应为止，乙醇用量约为3倍柱体积。
3.3.2.4 最佳工艺的实验
取银杏提取液2 mL，上样到装有10 g大孔树脂的层析柱中，吸附流速为2倍柱体积/h，再以2倍柱体积/h的水洗脱，弃去水洗液，然后以80%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液至180 mL，合并乙醇洗脱液，测定吸光度，计算总黄酮含量。精密吸取洗脱液150 mL，旋转蒸发仪初步干燥，然后置于真空干燥箱中充分干燥，得干浸膏质量。计算纯化后的干浸膏中黄酮得率。
150 mL提取液中黄酮含量=样品浓度×样品体积×稀释倍数=0.0451 g
干浸膏重量=0.1021 g
干浸膏中黄酮得率=提取液中黄酮含量/干浸膏重量×100%=44.17%
4 结语
为了确定银杏叶总黄酮用微波提取的最佳工艺，采用正交设计法对溶剂浓度、料液比、提取时间和提取次数4个因素进行考察，确定其对银杏叶总黄酮提取率的影响，由正交试验得出的优化工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶20、提取2次、微波低档作用3 min，在此条件下，黄酮提取率为2.161%。理论上来说，提取次数越多，黄酮的提取效果越好。但是，单因素试验中提取次数的结果表明提取两次时的效果最好，原因可能是因为提取次数进行到三次以上后，微波温度偏高，破坏了黄酮结构，黄酮提取率反而越低。
另外，以银杏叶黄酮含量的指标确定了大孔树脂纯化的最佳工艺参数，结论如下：（1）D101型、AB-8型、HPD400型大孔树脂中选用D101型作为纯化树脂；（2）通过实验筛选，以80%乙醇、2倍柱体积/h的流速洗脱、收集乙醇洗脱液至3倍柱体积，为最佳工艺。（3）经大孔树脂分离纯化后，黄酮含量由17.08%提高到44.17%，即经过纯化提取后黄酮的含量明显提升。在本研究过程中，银杏叶黄酮提取纯化所用溶剂仅有生物安全性较好的乙醇和水，没有其他有机溶剂及试剂的引入，适合应用于制药领域，因此本研究为银杏叶黄酮工业化的提取及生产提供了一定的参考和依据。
参考文献
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