摘要：目的比较红芪蜜炙前后化学成分差异，分析其差异标志物，为红芪蜜炙炮制机理及红芪与炙红芪质量标准研究提供参考。方法采用HPLC建立红芪与炙红芪样品指纹图谱，并测定香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量；采用SIMCA14.1软件对红芪与炙红芪各10批样品共有峰峰面积数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。结果红芪和炙红芪指纹图谱有19个共有峰，20、21号峰为红芪蜜炙后出现的色谱峰。炙红芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷和香草酸含量均显著降低（P＜0.01），分别降低48.00%、21.74%和48.24%；毛蕊异黄酮和芒柄花素含量均显著上升（P＜0.01），分别上升34.18%和17.49%。多元统计分析结果显示，红芪蜜炙前后化学成分存在显著差异，毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、香草酸、毛蕊异黄酮及芒柄花苷为其差异主要指标性成分。结论红芪与炙红芪成分差异显著，红芪蜜炙后产生了新的成分，毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、香草酸、毛蕊异黄酮及芒柄花苷可作为二者的差异标志物。
关键词：红芪；炙红芪；多元统计分析；含量测定；差异分析
红芪始载于《本草经集注》，为豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效[1-2]。红芪为甘肃道地药材，在甘肃武都、宕昌、岷县、舟曲、临潭、漳县、西和、礼县、武山等地有较广分布。炙红芪为红芪的蜜炙炮制加工品，主要具有补中益气功效[1]。2020年版《中华人民共和国药典》显示红芪与炙红芪主要功效存在差异，且二者质量控制均无指标性成分含量测定。目前对红芪成分已有一定研究[3-4]，但红芪炮制前后成分差异及炮制机理相关报道较少。本研究基于多元统计分析方法，深入比较红芪蜜炙前后化学成分差异，分析其差异标志物，为促进红芪与炙红芪质量标准研究并揭示其炮制机理提供依据。
1仪器与试药
Agilent1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；101-2A型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；AL104万分之一分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；BT125D十万分之一分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；HHS11S电热恒温水浴锅，余姚市上通温控仪器厂。对照品毛蕊异黄酮（批号150629）、毛蕊异黄酮苷（批号PS000687）、芒柄花素（批号150629）、芒柄花苷（批号PS000672）、香草酸（批号PS010559），HPLC纯度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司。甲醇（色谱级，批号20160305）、乙腈（色谱级，批号20151201）、磷酸（色谱级，批号20150707），天津大茂化学试剂厂。蜂蜜，周氏顺发食品有限责任公司。红芪药材样品采自甘肃省陇南市武都区米仓山，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根。
2方法与结果
2.1红芪饮片制备
将红芪药材抖去泥土，快速冲洗干净，稍晾，趁鲜切成厚片（0.2～0.4）cm，在阴凉通风干燥处阴干，备用。
2.2炙红芪样品制备
取一定量红芪饮片，加沸蒸馏水稀释过的炼蜜闷润1h，每100g红芪用炼蜜25g，水为蜜的20%。设定烘箱温度70℃，烘制时间2.5h，饮片铺设厚度3cm。烘制完成后，取出放凉，备用[5]。
2.3含量测定
2.3.1供试品溶液制备采用四分法分别取红芪和炙红芪饮片适量，粉碎（过20目筛），粉末60℃干燥至恒重。精密称取红芪和炙红芪样品粉末各3.0000g，置150mL锥形瓶中，加入甲醇30mL，于75℃水浴加热回流提取1h，过滤，滤液减压浓缩后，定容至10mL容量瓶，备用[6]。2.3.2对照品溶液制备分别精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、香草酸对照品5.16、5.13、4.71、5.47、4.93mg，加甲醇超声溶解，定容于5mL容量瓶中，分别制成各对照品贮备液。分别取上述对照品贮备液各1mL，定容至10mL容量瓶中，制成混合对照品溶液，备用。2.3.3色谱条件采用AgilentHC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～5min，乙腈2%～5%；5～20min，乙腈5%～16%；20～35min，乙腈16%～18%；35～36min，乙腈18%～30%；36～66min，乙腈30%～60%；66～80min，乙腈60%～90%），流速1.0mL/min，检测波长280nm，柱温30℃，进样量10μL。在此色谱条件下，色谱峰分离度良好。2.3.4线性关系考察分别精密移取“2.3.2”项下毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、香草酸对照品贮备液，加甲醇逐级稀释成不同浓度对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。结果表明，各对照品在相应范围内线性关系良好，见表1.2.3.5精密度试验精密吸取“2.3.2”项下混合对照品溶液1mL，按“2.3.3”项下色谱条件，重复进样6次，测定各成分峰面积并计算RSD。结果香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰峰面积RSD分别为0.46%、0.82%、1.02%、0.68%、1.42%，表明精密度良好。2.3.6稳定性试验取红芪同一供试品溶液，于4℃放置保存，分别于0、6、14、20、32h进样，测定各成分峰面积并计算RSD。结果香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素色谱峰峰面积RSD分别为0.79%、1.15%、1.07%、1.24%、1.76%，表明供试品溶液于4℃放置32h内基本稳定。2.3.7重复性试验精密称取炙红芪样品6份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定，计算各成分含量。结果香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的平均含量分别为20.40、52.21、90.05、79.20、144.96μg/g，RSD分别为1.67%、2.05%、2.48%、2.33%、1.27%，表明方法重复性较好。2.3.8加样回收率试验精密称取已知待测成分含量的同一炙红芪样品6份，每份约1.0000g，按待测成分含量1∶1比例分别精密加入香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定，计算各成分加样回收率，结果香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素平均加样回收率分别为98.02%、96.58%、97.44%、97.24%、96.37%，RSD分别为1.96%、2.13%、2.26%、1.66%、2.05%，见表2。2.3.9样品测定精密称取红芪和炙红芪样品各10批，按“2.3.1项下方法分别制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法进样，测定各共有峰峰面积，计算香草酸、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量，结果见表3。对照品色谱图见图1，红芪和炙红芪供试品指纹图谱见图2。红芪蜜炙后，毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷和香草酸含量均显著降低（P＜0.01），分别降低48.00%、21.74%和48.24%；毛蕊异黄酮和芒柄花素含量均显著上升（P＜0.01），分别上升34.18%和17.49%。
2.4多元统计分析
采用SIMCA14.1软件对红芪与炙红芪各10批样品中共有峰峰面积数据进行多维变量统计分析。2.4.1主成分分析主成分分析（PCA）主要反映组内聚集和组间分离趋势[7]。红芪和炙红芪的PCA得分图（见图3）显示，炙红芪与红芪明显分为两类，组内出现明显聚集。图3红芪和炙红芪PCA得分图2.4.2正交偏最小二乘判别分析采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进一步分析红芪与炙红芪差异。红芪和炙红芪OPLS-DA得分图（见图4）显示，红芪和炙红芪均表现出明显的聚类，且组间分离更加明显，表明红芪与炙红芪化学成分有显著差异。对所建立的OPLS-DA模型进行验证，通过置换测试以检查其过度拟合。R2和Q2分别表示累积的自变量X对Y的解释能力和模型的预测能力，理论上两者数值越接近1表明模型拟合越好。本研究建立的OPLS-DA模型R2和Q2分别为0.9935和0.9911。由图5可见，Q2截距＜0，且R2和Q2与横坐标的交点均小于0.5，两者与纵坐标的交点均小于1，表明该模型未过度拟合，且预测能力较好。进一步以VIP＞1为标准，筛选出红芪与炙红芪主要差异色谱峰。图6所示，21、20、13（毛蕊异黄酮苷）、14、7、17（芒柄花素）、12（香草酸）、16（毛蕊异黄酮）、5、11、2、15（芒柄花苷）、10、8号峰为二者差异的主要指标性成分。其中，21、20号峰为红芪蜜炙后新生成的色谱峰。
3讨论
红芪与炙红芪主要功效存在差异，而化学成分是药物产生药效作用的物质基础。本研究结果显示，红芪与炙红芪成分差异显著。多元统计分析结果表明，21、20、13（毛蕊异黄酮苷）、14、7、17（芒柄花素）、12（香草酸）、16（毛蕊异黄酮）、5、11、2、15（芒柄花苷）、10、8号峰为其差异主要指标性成分。含量测定结果显示，与红芪相比，炙红芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷及香草酸含量均显著降低，而毛蕊异黄酮和芒柄花素含量均显著上升。毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷均为黄酮苷类，其苷键易受热断裂而生成游离黄酮和糖基。红芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷在蜜炙过程中可能部分受热分解成毛蕊异黄酮和芒柄花素，从而使炙红芪中这2种游离黄酮含量升高。毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素和芒柄花苷均具有抗氧化、神经保护、抗菌、抗癌等作用[8-12]。香草酸是一种酚酸类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗细胞凋亡及抑制感染性结石形成等多种药理作用[13-17]。红芪和炙红芪中上述5种成分均具有广泛的药理活性，是其主要活性成分，也是红芪与炙红芪的差异标志物。2020年版《中华人民共和国药典》未明确红芪与炙红芪质量控制的指标性成分，因此，可以考虑选取上述5种成分作为红芪与炙红芪质量控制的指标性成分。
作者：牛江涛 曹瑞 司昕蕾 张育贵 张淑娟 李越峰 单位：甘肃中医药大学药学院 甘肃省中药质量与标准研究重点实验室
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