【摘要】 目的 探讨依据益肾活血清利法组方对uuo(单侧输尿管梗阻大鼠模型)大鼠的肾间质中ed1及nf-κb表达的影响。方法 制备单侧输尿管梗阻大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、益肾活血清利方组、益肾活血清利方高剂量组、苯那普利组。观察对术后21天大鼠肾间质ed1及nf-κb表达的影响。结果 中药各组较模型组大鼠肾间质ed1及nf-κb的表达差异均有显著性;苯那普利组对ed1的表达与模型组比较差异有显著性。结论 益肾活血清利方对肾间质纤维化过程中ed1及nf-κb表达具有良好的防治作用，苯那普利组可以抑制uuo大鼠肾间质ed1的表达。
【关键词】 益肾活血清利方;单侧输尿管梗阻(uuo);ed1(巨噬细胞);nf-κb(核转录因子)
effect of yishen huoxue qingli recipe on ed1 and nf-κb in nephridial tissue of unilateral ureteral obstruction rat
sun shi-zhu,sun wei,wang ji-ming,et al. gerontological research center of jiangsu,nanjing 210024,china[abstract]objective to identify whether yishen huoxue qingli recipe plays an important role in vivo in preventing the development of tubulointerstitial fibrosis after unilateral ureteral obstruction in s to establish the uuo model in vivo，the rats were randomly divided into five groups：sham opermion group， model group，the yishen huoxue qingli chinese medicine group，the high dosage chinese medicine group and the benazepril 21 days the expression of ed1 and nf-κb was detected by immunohistochemistry. result the expression level of ed1 and nf-κb in the uuo group were significantly ed1 level of the groups with drugs was less than the uuo group，the role in the chinese medicine group(p<0.01),the high dose chinese medicine group, and the benazepril group is gradually lower (p<0.05);the level of nf-κb is gradually lower with the ed1 decreasing expression，the chinese medicine group plays a remarkably preventive role (p<0.01)，the benazepril group is not high dose chinese medicine group can decrease the expression of nf-κb;conclusion yishen huoxue qingli recipe could reduce the expression of ed1 and nf-κb in mace kidney with unilateral ureteral obstruction，and prevent renal interstitial pril only could reduce the expression of ed1 in mace kidney.
[key words] yishen huoxue qingli recipe;unilateral ureteral obstruction(uuo);ed1; nf-κb
肾间质纤维化是多种慢性肾脏疾病走向终末期肾功能衰竭的共同路径，肾小管间质纤维化病变特点为肾小管上皮细胞变性、萎缩和消失,肾间质淋巴和单核细胞浸润和纤维化。其中大量单核巨噬细胞的浸润是其主要特点之一。单核巨噬细胞分泌的炎症因子il-1还可以通过激活蛋白酪氨酸激酶(pkcs)启动nf-κb的转录活性，进一步增强多种炎症因子的转录和表达，由此引发炎症损伤的“瀑布效应”，造成肾脏直接损伤(炎性细胞浸润、肾小球系膜细胞、小管上皮细胞增殖)，同时还可刺激转化生长因子(tgf-β)分泌增加。我们以益肾活血清利为原则组方，采用单侧输尿管梗阻(uuo)模型大鼠，观察其对肾间质纤维化过程中ed1及nf-κb表达的影响。
1 材料
1.1 动物 雄性sd大鼠，40只，体重150～170g，由南京青龙山动物饲养厂提供(许可证号：scxk-2001-0018)。
1.2 药物 根据益肾活血清利法组方(主要由杜仲、川芎、白花蛇舌草等中药组成，购自南京药材采购供应公司)，水煎分别浓缩至每1ml含生药1g (低剂量)、2g(高剂量)，由江苏省中医院制剂室制备。盐酸苯那普利(洛汀新)由北京诺华制药有限公司生产，市售。
1.3 实验仪器 leica光学显微镜(型号：dm ls2)。
1.4 实验试剂 ed1一抗为鼠抗鼠巨噬细胞ed1(cd68)单克隆抗体，chemicon international (a serological ccompany)，美国。nf-κb一抗为核转录因子nf-κb单克隆抗体，二抗为辣根过氧化酶(hrp)标记的链菌素抗生物素igg (hrp-polymer goat anti-ms/rb igg)，福州迈新生物技术开发有限公司。磷酸盐缓冲液pbs、dab显色液，均为福州迈新生物技术开发有限公司。
2 方法
2.1 造模及给药方法 将40只大鼠随机分为假手术组、模型组、益肾活血清利方组、益肾活血清利方高剂量组(2ml/100g)、苯那普利组(45mg/kg)，提前1天给药，每天2次灌胃。以2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，行左侧输尿管结扎术[1]。无菌手术打开腹腔，分离右侧输尿管, 在肾盂处和输尿管上1/3处用3号线双重结扎输尿管，分层缝合关闭腹腔;假手术组仅将输尿管游离但不结扎。术后21天称重后处死大鼠，留取梗阻侧肾脏标本，置于10%中性甲醛固定液中保存，用以作有关病理检查。
2.2 肾组织标本ed1及 nf-κb免疫组化检查 免疫组化在江苏省中医院病理科进行。采用改良sp法：(1)脱蜡修复液修复10min，微波450w，停留15min，自来水冷却，pbs洗3次，各2min。(2)加羊血清孵育10min，加第一抗体，室温1h，pbs洗3次，各2min。(3)加第二抗体，室温15min，pbs洗3次，各2min。(4)dab显色液显色，水洗;苏木素复染1min，水洗;(5)1%盐酸酒精分化数秒，各级酒精脱水，二甲苯透明。(6)中性树胶封固，光镜下观察。
肾小管间质ed1及 nf-κb免疫组化染色阳性面积测定：在光学显微镜(×400倍)宁阙病理计算机图像分析系统屏幕上计算每例切片20个不重叠视野中阳性染色面积的吸光度值并取平均值，吸光度值越大，表明表达量越多。
2.3 统计学处理 所有计量数据以(x±s)表示，采用单因素方差分析。计算采用spss11.5软件进行。
3 结果
3.1 肾形态学检查 肉眼观察可见各结扎鼠左肾(术侧)肿大，颜色变浅，有囊性感，内含混浊的褐色尿液，肾实质变薄或消失;右肾稍肿大、颜色稍浅，肾组织结构清楚。
3.2 肾组织标本ed1/ nf-κb免疫组化染色阳性面积 uuo术后21天假手术组右肾小管轻度变性，模型组大鼠右肾小管间质纤维组织呈片状分布，ed1表达以肾间质明显，其中模型组与假手术组比较，p<0.00;中药组、中药高剂量组及苯那普利组表达与模型组比较，p<0.01;中药组、中药高剂量组与假手术组比较，p<0.05;苯那普利组表达与假手术组比较，p<0.01(详见表1及附图1)。
nf-κb表达以肾间质明显，其中模型组、中药组与假手术组比较，p<0.01;中药高剂量组表达与模型组比较，p<0.05(详见表1及附图2)。表1 肾组织免疫组化ed1、 nf-κb光密度阳性表达值图1 uuo大鼠肾组织ed1免疫组化表达(×400) 说明：nf-κb在正常组(ⅰ)表达量极少，模型组(ⅱ)已丧失正常间质结构，广泛表达nf-κb，中药组(g)、中药高剂量组(h)及洛汀新组(x)的表达依次增强。图2 uuo大鼠肾组织nf-κb免疫组化表达(×400)
4 讨论
益肾活血清利方是根据慢性肾病“肾虚湿瘀”理论总结的治疗原则组方，本方实验结果显示对uuo大鼠肾间质纤维化进程有着显著的干预作用[2]。慢性肾间质纤维化是多种肾脏疾患进展至终末期肾病的共同通路，与肾损害进展密切相关，决定肾功能的预后[3]。肾间质巨噬细胞积聚可促进肾间质纤维化的发生和进展[4]，巨噬细胞进入肾间质后，分泌一系列促纤维化因子，如tgf-β、fgf、tnf-α、pdgf、egf等，这些细胞因子可使肾间质肌成纤维细胞合成timp、纤溶酶原激活剂抑制物(pai 1)增多，使基质金属蛋白酶(mmp)减少，从而影响基质转运，加重肾间质纤维化[4]。本实验用药各组对ed1的积聚有着明显的抑制作用，但中药组优于西药组。
过量表达的趋化及粘附分子如单核细胞趋化蛋白mcp-1、vcam-1、icam-1等，可导致组织局部单核/巨噬细胞浸润[5]。nf-κb是一种重要的核转录因子，通常情况下，与其细胞内抑制物iκb结合，以非活性形式存在于胞浆中，当被激活后，nf-b/ iκb复合物解离，nf-κb进入细胞核，在核内与多种基因启动子特异性序列结合，调节这些基因的转录活性，其中包括mcp-1、vcam-1、icam-1等[6]。体外实验已发现高糖能通过pkc-nf-b途径引起系膜细胞活化，并分泌粘附分子，导致单核/巨噬细胞浸润[7，8]。笔者研究发现ed1表达减少的各组nf-κb表达亦轻，中药各组对nf-κb的积聚有着明显的抑制作用，且优于西药组。从而可见中药抗肾纤维化的潜力是值得深入挖掘的。
【参考文献】
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2 孙世竹，孙伟.益肾活血清利方对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的防治作用.中国中医药信息杂志，2005，12:30-32.
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