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急性胰腺炎导致ards的发病机制(急性胰腺炎肺损伤机制)

2022-11-05  本文已影响 461人 
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 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是临床上较为常见的危重疾病,病情进展较为迅速,容易引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),进而引起多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。而急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是SAP早期较为常见且严重的并发症之一[1-2],研究表明髓系细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)可以选择性表达在中性粒细胞、CD4+单核/巨噬细胞上,且具有触发并放大炎性反应的作用,是炎性反应信号传导通路的重要介质之一[3-4]。本实验通过制作SAP时ALI模型,研究TREM-1及相关炎症因子在SAP时ALI中的表达,进而寻求SAP肺损伤的相关发病机制及治疗。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物和试剂
  健康雄性SD大鼠24只,9周龄,体质量250~350 g,由江苏大学动物实验中心提供。牛磺胆酸钠(美国Sigma公司),LP17(人工合成的TREM-1多肽,由上海洁尔生化合成),CD68单克隆抗体(香港abcam公司),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒(上海Fermentas公司),QRT-PCR试剂盒(美国Bio-Rad公司),引物(由上海生工合成)等。
  1.2 实验方法
  1.2.1 动物分组及动物模型的建立 SD大鼠24只,随机(随机数字法)分为SO组 (假手术组)、SAP组和SAP+LP17组(LP17为人工合成的TREM-1多肽),每组8只。术前禁食24 h(不禁饮),经腹腔按0.4 ml/100 g的剂量注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠。采用逆行胰胆管技术制备SAP大鼠模型,麻醉后固定消毒腹部皮肤,行上腹部正中切口进腹,充分暴露胰胆管及肝门,在近肝门端以血管夹夹闭近肝门部胰胆管,于十二指肠乳头附近用注射器针头穿刺十二指肠壁然后逆行穿入胰胆管,SAP组及SAP+LP17组均缓慢注射1 ml/kg的5%牛磺胆酸钠,SO组注射1 ml/kg生理盐水,注毕停留5 min后拔针关腹。SAP+LP17组术前先经尾静脉注射LP17(1 mg/0.1 ml生理盐水),SAP组及SO组均经尾静脉注射等量生理盐水。
  1.2.2 组织病理学观察 造模成功12 h后处死大鼠取胰腺及左肺组织,10%甲醛溶液固定,修剪、脱脂、石蜡包埋和切片,HE染色后光镜观察。胰腺及肺组织损伤病理评分标准参照文献[5]。
  1.2.3 免疫组织化学法 肺组织石蜡切片经脱蜡水化后,3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育10 min以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS液洗5 min,共3次,5%正常山羊血清室温封闭10 min。弃去血清,加入1∶100稀释的CD68抗体(一抗),4 ℃过夜。PBS液冲洗5 min,共3次,加入1∶200稀释的山羊抗小鼠(二抗),室温孵育l h,PBS液洗5 min,共3次,加入DAB显色液显色3 min,自来水充分冲洗,苏木素复染,常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察并拍照。
  1.2.4 荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR) 肺组织于液氮中保存。各组取肺组织100 mg,按Trizol试剂说明书提取总RNA,采用逆转录试剂盒逆转录成cDNA,引物序列:内参β-actin(P1:5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’,P2:5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’,扩增片段:211 bp);TREM-1(P1:5’-AAGTATGCCAGAAGCAGGAAGG-3’,P2:5’-GGTAGGGTCATCTTTCAGGGTGT-3’,扩增片段:138 bp);IL-1β(P1:5’-AATACCACTTGTTGGCTTA-3’,P2:5’-TGTGATGTTCCCATTAGAC-3’,扩增片段:130 bp);TNF-α (P1:5’-CGTCGTAGCAAACCACCAAG-3’, P2: 5’-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3’,扩增片段:426 bp),反应条件:95 ℃ 30 min,95℃ 5 min,β-actin、TREM-1、TNF-α 58 ℃/ IL-1β 52 ℃ 30 min,72 ℃ 30 min,共45个循环。以2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量(以SO组表达量为1,2-ΔΔCt值即为目的基因较SO组基因表达的倍数)。
  1.3 统计学方法
  计量资料采用均数±标准差(x±s)表示, 采用SPSS 17.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,单因素方差分析后进一步Post-hoc分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。
  2 结果
  2.1 大鼠SAP模型的鉴定及胰腺病理评分
  肉眼可见SAP组胰腺坏死,质地较硬,呈灰白色;光镜下胰腺间质出血、水肿、坏死,腺泡细胞变性坏死,失去正常结构,大量炎性细胞浸润。SAP+LP17组肉眼及光镜下观察胰腺坏死较SAP组减轻。SO组正常。病理评分见表1。
 2.2 肺组织组织病理学检查及病理评分
  肉眼可见SAP组肺水肿明显,表面弥漫性出血点;光镜下肺组织间质、肺泡及气管内出血,肺泡塌陷,炎性细胞浸润。SAP+LP17组肉眼可见肺轻度水肿;光镜下见间质轻度水肿、充血,少量炎性细胞浸润。SO组正常。病理评分见表1。
  2.3 肺组织CD68标记的免疫组化
  各组大鼠肺组织切片CD68标记的免疫组化结果见图1。其中SO组肺间质及肺泡中偶见巨噬细胞浸润,SAP组肺间质及肺泡中有大量巨噬细胞浸润,而SAP+LP17组肺间质及肺泡中巨噬细胞浸润明显减少。
  2.4 肺组织TREM-1、IL-1β和TNF-α mRNA的表达
  造模成功后12 h,SAP组肺组织TREM-1 mRNA表达较SO组增强,差异具有统计学意义(P<0.01);SAP+LP17组表达较SAP组减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时IL-1β mRNA表达亦较SO组及SAP+LP17组增强,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05);TNF-α mRNA表达亦较SO组及SAP+LP17组增强,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见图2、图3、图4。
  3 讨论
  ALI是SAP较为常见的并发症,而ARDS和MODS是导致患者死亡的主要原因,因此早期治疗和预防ALI对降低SAP的病死率及改善预后具有重要意义[6-7]。刘宁等[8]发现ALI时肺组织中TREM-1表达明显升高,且与IL-1β和TNF-α的水平以及肺损伤程度呈正相关。近年来众多学者对SAP急性肺损伤进行了相关研究,但其发病机制尚未完全阐明,本实验主要通过研究TREM-1及相关炎症因子在SAP合并ALI时表达量的变化,探讨SAP肺损伤的相关发病机制。
  有研究结果显示,TREM-1不仅在传染性疾病中表达增加,在非传染性疾病(局部炎症和全身性炎症反应)中亦表达增加[9-11]。本研究结果显示SAP造模成功后肺组织TREM-1 mRNA表达均明显增加,SAP时TREM-1可以触发及放大炎症反应,细胞因子可以自身激活,产生瀑布效应[12]。本课题组前期研究发现SAP造模成功后2 h肺损伤病理评分即开始增高,出现ALI[5],也发现TREM-1随疾病的严重程度及实验的进展表达逐渐增加,约12 h达峰值[13]。这些结果表明TREM-1可能是SAP急性肺损伤的重要炎性调节介质。Gibot等[14]研究表明 TREM-1表达上调可调节其下游的IL-1β、TNF-α等细胞因子的表达,从而触发和放大炎症反应,导致SIRS和脓毒症的发生。本研究结果显示TNF-α和IL-1β在SAP造模成功后12 h,较SO组高2.8~3.2倍(P<0.01)。因此,TREM-1在SAP急性肺损伤炎症反应中扮演重要角色。LP17是一种人工合成的具有保守序列的17肽蛋白,含有TREM-1胞外区的‘F’13链重叠区,它可以模拟TREM-1胞外区和TREM-1的天然配体竞争性结合从而阻断TREM-1信号转导通路[15]。Kamei等[16]研究发现SAP时LP17可以有效抑制血清中sTREM-1的表达,从而减轻了SAP引起的肝、肾功能损伤。Gibot等[17-18]研究亦发现LP17可以在脓毒症、肺炎及肠黏膜缺血-再灌注过程中有效地阻断TREM-1通路。据此本研究通过LP17阻断TREM-1通路后,SAP+LP17组较SAP组TREM-1表达下降(P<0.05),病理切片示炎性细胞明显减少。这表明TREM-1是SAP相关肺损伤的一个潜在治疗靶点,LP17可以有效降低TREM-1的表达,减少炎症因子的释放,从而有利于减轻SAP引起的ALI。最近的研究显示,膜结合的TREM-1蛋白在SAP患者的胰腺、肝脏及肾脏中表达均增加[19]。Routsi等[20]亦通过研究发现TREM-1在脓毒症或严重脓毒症向感染性休克演变的过程中表达明显增加,进而表明TREM-1可能与多器官功能障碍的发生有密切联系。
  近年来随着对SAP研究的不断深入,发现SAP时体内大量促炎细胞因子的释放可以引起局部及全身病情的不断恶化,而巨噬细胞的浸润与激活在此过程中起着至关重要的作用[21-22]。CD68是一种位于胞质内的高度糖基化的膜蛋白,被作为巨噬细胞活化的标记物,当巨噬细胞被激活时其表达增高[23]。因而本实验通过CD68免疫组化染色观察SAP肺损伤时肺巨噬细胞的浸润情况,结果显示SAP肺损伤时巨噬细胞被明显激活,肺泡及肺间质组织中巨噬细胞浸润明显,而相关研究已显示TREM-1主要表达于成熟的单核/巨噬细胞和中性粒细胞表面[2]。因此,笔者认为SAP可以使肺组织内巨噬细胞的浸润与活化,进而引起TREM-1的表达增高,TNF-α和IL-1β等炎症因子释放增加,最终导致ALI。
  综上所述,TREM-1在SAP肺损伤中表达显著增高,可以触发和放大炎症反应,可能是SAP急性肺损伤机制中的一个重要炎症调节介质。LP17可以有效降低TREM-1的表达,减少炎症因子的释放,从而有利于减轻ALI。由于SAP急性肺损伤发生机制较为复杂,多种因素参与其中,因此具体发病机制有待进一步研究与探索。
  参考文献
  [1]Marsboom G, Janssens S. Endothelial progenitor cells: new perspec tives and applications in cardiovascular therapies [J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2008, 6(5): 687-701.
 作者单位:212001 江苏省镇江,江苏大学附属医院普外科(祝文蕊、党胜春、王坤、沈耀、王平江、侯雯跻、张建新);江苏大学医学基础与技术学院(端礼荣),临床医学院(张晨)

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