[摘要] 目的 研究复方藤梨根制剂（FFTLG）对人胃癌裸鼠腹腔移植瘤的抑制效应及其与瘤组织核转录因子（NF-κB p65）表达的关系。 方法 建立人胃癌裸鼠腹腔移植模型。24只裸鼠随机分为4组：FFTLG高、中、低剂量组和生理盐水组，分别观察荷瘤裸鼠腹腔移植瘤的生长情况，检测NF-κB p65的表达。 结果 生理盐水组、FFTLG低、中、高剂量组的抑瘤率分别为0、7.8%、30.0%和33.3%，FFTLG各组与生理盐水组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；腹腔瘤组织中NF-κB p65阳性表达细胞百分比分别为（39.67±19.82）%、（33.00±19.94）%、（29.20±17.68）%、（27.17±15.75）%。FFTLG组的中、高剂量组与生理盐水组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 FFTLG对裸鼠腹腔移植瘤生长具有抑制作用，且随着剂量的增加其作用增强，其作用途径之一可能是通过下调NF-κB p65的表达。
[关键词] 复方藤梨根制剂；胃肿瘤；移植瘤；裸鼠；核转录因子
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（b）-0013-03
胃癌目前仍是严重危害人类健康的恶性肿瘤，在世界范围内居各种恶性肿瘤发病的第4位，死因第2位。我国胃癌目前每年死亡约36万人，占各类恶性肿瘤死因的第2位[1]。即使获得根治性手术切除的患者，5年生存率仅为30%，绝大多数患者死于胃癌的复发和转移[2]。因此，对胃癌浸润和转移的研究已成为当前的主要任务之一。但是对于肿瘤转移的防治方面，尚无可靠的方法应用于临床。探索中医药在这一领域作用和优势越来越受到广泛的重视。本实验研究复方藤梨根制剂对裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用及其与NF-κB p65表达的关系，以期为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
BALB/c-nu/nu裸鼠24只，鼠龄（51.5±0.5）周，体重21.5～25.5 g，全部雄性。
1.1.2 细胞株
经裸鼠皮下传代至第8代的人胃癌SGC-7901细胞株。
以上两者由浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.1.3 实验用药
复方藤梨根制剂（FFTLG）：由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、白术、党参、茯苓、薏苡仁等组成。由浙江省中医院提供。上述药材按比例加水煎煮，并浓缩至0.5、1.0、2.0 g/mL，分装于消毒后的玻璃瓶中，储存于4℃冰箱内备用。裸鼠中药给药剂量按药理学实验动物给药方法马氏定理计算，以成人剂量/体重30.0、15.0、7.5倍灌胃给药。
1.1.4 主要试剂
NF-κB p65鼠抗人免疫组化染色试剂盒（二步法）、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RMPI-1640细胞培养液由浙江大学实验动物中心惠赠。
1.2 方法
1.2.1 人胃癌裸鼠腹腔种植模型的建立
取第8代裸鼠皮下移植瘤，切成小块，与细胞培养液混合，无菌条件下研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙丝网，镜下调整浓度至约1×107/mL，抽取细胞悬液注入裸鼠腹腔（0.2 mL/只）。入选裸鼠24只，将其笼于无特定病原的条件下饲养。
1.2.2 实验分组及给药
将造模后裸鼠随机分为4组，6只/组。接种后18 d开始给药，所有裸鼠按照组别不同每天灌服相同体积生理盐水、低、中或高浓度复方藤梨根制剂0.6 mL，连续21 d后停止给药。
1.2.3 观察指标
1.2.3.1 裸鼠肠系膜种植瘤瘤量 末次灌药后50 d应用引颈脱臼法处死裸鼠并解剖腹腔，自根部将肠系膜连同上面的移植瘤一起剪下称重。
1.2.3.2 抑瘤率 抑瘤率（%）=（对照组瘤重-用药组瘤重）/对照组瘤重×100%。
1.2.3.3 免疫组化法测定NF-κB p65基因的表达 将移植瘤常规石蜡包埋，切片，SP法免疫组化染色，采用免疫组化二步法。阳性细胞计数：镜下观察，以细胞核或细胞浆中出现清晰棕黄色颗粒为阳性反应。每张切片选5个高倍视野，计算阳性细胞数占同类细胞的百分比并记录。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件包进行统计。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验情况
所有入组裸鼠造模成功，腹腔接种胃癌细胞后均有肿瘤生长，接种后13 d可触摸到裸鼠腹腔内出现肿瘤结节，大小不等，进行性增大；19 d始可观察到裸鼠腹围增大。实验过程中，肿瘤持续生长，裸鼠腹围持续增大，生理盐水组增长最快，未出现不生长或肿瘤自发消退现象。
解剖裸鼠肉眼可观察到大多数裸鼠腹腔内有血性腹水生成，量多少不等，横膈、腹膜、肠系膜、肝周、网膜、盆腔等多处见肿瘤结节、肿块，呈灰白色，质地偏硬，与周围组织粘连，部分有坏死，直径从0.1～3.0 cm大小不等。提示移植瘤未被排斥，肿瘤移植成功。见图1、2。
2.2 抑瘤作用
移植瘤重量方面，各组比较结果相同：FFTLG中、高剂量组与生理盐水组比较、FFTLG高剂量组与低剂量组比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；中剂量组与低剂量组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；FFTLG高剂量组与中剂量组比较、低剂量组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。NF-κB p65表达量方面，FFTLG高、中剂量组与生理盐水组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；FFTLG低剂量组与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；FFTLG高、中、低剂量组之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。NF-κB p65表达结果显示，所有切片镜下均可见细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒，多少不等。见图3、4。
3 讨论
恶性肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤患者以虚实夹杂、正虚邪实居多，故中医肿瘤治疗大法一般在扶正基础上兼顾攻邪。笔者在本实验中所用的复方藤梨根制剂由浙江省中医院肿瘤科于20世纪70年代形成的“三根糖浆”发展而来，是浙江省中医院肿瘤科临床治疗消化道恶性肿瘤的常用方，由藤梨根、虎杖根、水杨梅根、党参、茯苓、白术、薏苡仁等组成，其中藤梨根、虎杖根、水杨梅根具有清热解毒作用，虎杖根、水杨梅根兼具活血化瘀作用，党参、茯苓、白术具有补气健脾作用，薏苡仁具有健脾、利水渗湿作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血化瘀、补气健脾等功效。从药理成分分析，藤梨根含有猕猴桃碱、熊果酸等，虎杖根含有白藜芦醇等成分，水杨梅根含有水杨梅甲素及生物碱等化合物，均为有效的抗癌成分；薏苡仁的主要成分为薏苡仁油、薏苡仁酯、甾醇、氨基酸等，对癌细胞有抑制作用。益气健脾药党参、白术、茯苓有增强宿主免疫功能的作用[3-5]，可全面调节身体内环境的平衡，重建机体抗癌能力。
本实验中测定移植瘤瘤重及抑瘤率结果显示，FFTLG高剂量组瘤重最小，抑瘤率最高，FFTLG中、低剂量组效果相对较差，生理盐水组瘤重最大，FFTLG低剂量组与生理盐水组比较无统计学意义（P > 0.05），提示FFTLG制剂可抑制胃癌腹腔种植瘤生长，呈剂量相关性。
NF-κB是一种转录因子，对肿瘤的发生、发展过程起重要作用，NF-κB p65是NF-κB 的活化成分。近些年，以Van[6]和Karin[7]为代表的很多研究证实了NF-κB所调控的基因在癌细胞增殖、浸润、新生血管形成、耐药、转移等多个方面都起到了重要的作用。在胃癌细胞和组织中表达激活与胃癌的形成、发展、浸润转移密切相关，并在某种程度上决定着患者的预后[8-9]。
就腹腔瘤组织NF-κB p65的表达而言，本次实验中FFTLG高、中剂量组与生理盐水组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；FFTLG低剂量组与生理盐水组比较，FFTLG高、中、低剂量组之间比较均无统计学意义（P >0.05）。分析认为，FFTLG制剂可抑制荷瘤裸鼠肿瘤组织NF-κB p65的表达，且随剂量增大而作用增强，FFTLG高、中剂量组效果显著。提示FFTLG制剂可降低胃癌裸鼠腹腔种植瘤组织NF-κB p65的表达且呈剂量相关，其抑制SGC-7901人胃癌细胞腹腔转移的途径之一可能是通过下调NF-κB p65的表达。
[参考文献]
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[4] 姚淑娟，刘伯阳，孙艳.白术对荷瘤鼠NK和IL-2活性的影响[J].专题研究，2005，34（12）：52.
[5] 李涌健.益气养阴法防治癌转移的实验研究[J].中西医结合学报，2004，2（1）：49-51.
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[7] Karin M. Nuclear factor-kappa B in cancer development and progression [J]. Nature，2006，441（7092）431-436.
[8] 王勇，史朝晖，姜希宏.核因子-κB在胃癌组织中的表达及其与临床病理的关系[J].山东医药，2004，44（6）：19-20.
[9] 周忠勇，孙俊聪，史朝晖，等.NF-κB p65和EGFR在胃癌组织中的表达及意义[J].山东医药，2005，45（23）：50-51.
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