第1篇：靶向止痒治疗药物的学术探讨
靶向药物是目前治疗肿瘤的热门药物，其原理是使药物瞄准肿瘤部位，在局部保存相对高的浓度，延长药物的时间，提高对肿瘤的杀伤力，而对正常组织细胞作用较小。因此它不像细胞毒性那样的化疗药物有明显的消化道反应、骨髓抑制、脱发等毒副作用，但是靶向治疗也有两类副作用。一个是皮疹反应，其次是轻度腹泻。
分子靶向药物导致的皮疹主要表现为皮肤色素沉着、肿胀或红斑，脱屑、皲裂、硬结样水泡或严重的疼痛等，常伴皮肤瘙痒或化脓。皮疹主要发生在脸面或腰背部，部分患者甚至蔓延至全身，面目全非，痛苦不堪，严重影响生活质量，有的患者被迫停药。另一方面，有研究显示，靶向治疗药物出现皮疹是药物有效的表现。临床医生也会以此作为判断疗效的依据之让治疗继续推进下去。因此，对于靶向药物所致的皮疹主要予以对症治疗。中草药因其药性缓和、毒副作用小，受到高度关注。在中医理论中，分子靶向药物所致皮肤毒性属于“药毒”范畴，主要是“肺热血瘀”，用宣肺凉血祛瘀之中药可辨证论治。
苏州大学附属第一医院协定处方‘‘消疹止痒方”作为外用中药处方，由紫草、野菊花、侧柏叶、冰片等5味中药组成，功能解毒透疹、利湿止痒，在临床应用过程中可有效改善靶向药物所致的皮疹反应。但由于传统汤剂使用携带不便，笔者拟将其开发为中成药制剂，即“消疹止痒喷剂”。本文对其进行了药效学研究，考察其对皮炎和瘙痒模型动物的药理作用及作用机制，为新制剂的开发应用奠定基础。
1材料
1.1动物ICR小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由苏州大学医学院实验动物中心提供，动物许可证号SYXK(苏）2007—)035。实验过程中，小鼠自由摄食和饮水，环境温度控制在18～22°C，湿度控制在50%～60%，昼夜12h父替。
1.2药物与试剂制剂原料药购自苏州市天灵中药饮片有限公司，经南京中医药大学王春根教授鉴定，紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma的干燥根，野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemumindicum头状花序，侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladusorientalis的干燥枝梢和叶，地肤子为薬科植物地肤Kochiascoparia的干燥成熟果实，冰片为合成龙脑。消疹止痒喷剂（苏州大学附属第一医院制剂室，批号20140401)，哈西奈德乳膏（天津太平洋制药有限公司，批号8613002)，2，4-二硝基氯苯（DNCB，北京化学试剂厂，批号130920)，丙酮（无锡市展望化工试剂有限公司，批号120910)，白细胞介素4(IL-0，y-干扰素（IFN-/)试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号140102)，止痒醑（苏州大学附属第一医院制剂室，批号20140516)，右旋糖酐(江苏正大丰海制药有限公司，批号1403291)。
1.3仪器Centrifuge5804R型离心机（北京博仪恒业科技发展有限公司），CH4～B型测厚仪（上海精密仪器有限公司），XS105DualRange型电子分析天平（美国MettlerToledo公司），BX50型电子显微镜（日本Olympus公司）。
2方法
2.1接触性皮炎模型和瘙痒模型的制备6取ICR小鼠40只，于实验前1d剃净每只小鼠腹部毛发，面积约3cmX3cm，实验当日用质量/体积分数5%DNFB-丙酮溶液100斗涂抹于腹部剃毛处，使其致敏。第2天再涂抹100强化致敏。5d后在小鼠右耳壳正反两侧均匀涂抹1%DNCB-丙酮溶液各20^L予以激发，同时左耳涂等剂量丙酮溶液，每隔3d激发1次，共激发4次（第6，9，12，15天予以激发），即得接触性皮炎小鼠模型。取ICR小鼠40只，雌雄各半，提前1d脱去小鼠头颈部耳后皮肤的毛备用，各实验组连续给药3d，末次用药1h后脱毛部位ih右旋糖酐0.2mL/次，即得小鼠瘙痒模型。
2.2分组与给药将接触性皮炎模型小鼠随机分为模型组、阳性药哈西奈德乳膏组（0.01g?kg—1)，消疹止痒喷剂高和低剂量组（1，0.5g?kg—1)，每组10只，另取10只未致敏小鼠作为正常组。各组分别于致敏后1h时将相应剂量受试物均匀涂于各小鼠右耳的正反两面，如遇激发日期，则在每次激发后2h时再将受试物均匀外涂，正常组和模型组分别给予生理盐水，连用15d。末次激发后24h时处死小鼠，并检测相关指标。将瘙痒模型小鼠随机分为模型组、阳性药止痒醑组（1g*kg—1)，消疹止痒喷剂高、低剂量组（1，0.5g一kg—1)，每组10只，各组分别将相应剂量受试药物均匀涂抹于脱毛部位，模型组涂抹生理盐水，连续用药3d。以小鼠前爪搔头部、后爪搔躯干、嘴咬全身各部位作为瘙痒指征，记录第1次挠痒后15min内小鼠瘙痒次数。
2.3观察指标
2.3.1耳破损情况于每次激发后24h时观察各组小鼠右耳破损情况，并统计得分。明显红肿增厚及渗出或明显角化结痂者记3分；轻度红肿，渗出不明显，或中度角化者记2分；红肿和渗出均不明显，或轻度角化者记1分；正常皮肤为0分&]。
2.3.2耳厚度差于诱导前及每次激发后24h时用测厚仪测量右耳中部厚度，计算激发前后的右耳厚度差。
2.3.3耳质量差末次激发后24h时处死小鼠，用直径为8mm的打孔器在两耳中部钻取左、右圆耳片，称重并计算左、右耳的质量差。
质量差=右耳质量-左耳质量
2.3.4耳组织病理学将小鼠右耳片放入体积分数10%甲醛->BS溶液中固定，制成石蜡块，纵切，HE染色，在光学显微镜下观察耳片病理学变化。
2.3.5血清IL4及IFN-K的检测摘除小鼠眼球取血各1mL，-1离心15min。取血清按照试剂盒说明，用ELISA法测定IL4及IFN-K含量。
2.3.6瘙痒次数自瘙痒模型小鼠第1次发生挠痒动作起，记录15min内的挠痒总次数。
2.4统计学分析用SPSS16.0统计软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，各组之间样本均数的比较用LSD检验；计数资料的比较用；x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1对接触性皮炎小鼠耳破损结痂数的影响经过DNCB的致敏和激发后，小鼠的耳廓有了明显的肿胀，且随着激发的次数增加，其肿胀度就明显地增加，皮损也逐渐严重，并且形成了明显的结痂现象，与模型组比较，消疹止痒喷剂能有效缓解DNCB致敏引起的耳破损结痂现象。
3.2对接触性皮炎小鼠激发前后右耳厚度差的影响与正常组比较，模型组小鼠右耳厚度明显升高(P<0.01)；与模型组比较，消疹止痒喷剂高、低剂量组均能显着减少小鼠右耳厚度差（P<0.01)。
3.3对接触性皮炎小鼠左右耳片质量差的影响与正常组比较，模型组左右耳片质量差明显升高（P<0.01)；与模型组比较，消疹止痒喷剂高、低剂量组均能显着减少左右耳片质量差（P<0.01)。
3.4对小鼠耳组织病理学的影响正常组小鼠耳部皮肤组织学结构清楚、层次分明，表皮厚度正常，细胞内及细胞间无水肿，无明显淋巴细胞浸润。接触性皮炎模型组小鼠耳表皮增厚，可见轻度细胞内水肿及轻中度细胞间水肿，真皮浅层大量单一核细胞浸润，以淋巴细胞为主。可见嗜酸性细胞核肥大细胞，散在多形核细胞浸润，真皮血管扩张充血，少见红细胞外渗。阳性药和各试药组不同程度改善接触性皮炎模型小鼠耳部炎症浸润。
3.5对接触性皮炎小鼠血清中IL4和IFN-K含量的影响与模型组比较，消疹止痒喷剂高、低剂量组能显着减少IL4水平的升高（P<0.01)，能减少IFN-/水平的降低（P<0.05)，且呈现出一定的量-效关系。瘙痒次数的记录。
4讨论
消疹止痒喷剂高、低剂量组均能一定程度地抑制接触性皮炎模型小鼠右耳部结痂的形成、减轻右耳肿胀度、降低左右耳片的质量差、降低其血清IL-4水平、并且升高其血清IFN-Y水平，对瘙痒模型小鼠具有一定止痒作用，使各项指标水平均优于模型组，并且表现出了量-文依赖关系。
“消疹止痒喷剂”处方中紫草性寒、味甘咸，功能清热凉血，活血消肿，解毒透疹，为主药；野菊花辛散苦降，长于解毒消痈，地肤子苦寒降泄，清热利湿而止痒，合为臣药；侧柏叶苦涩性寒，善清血热，为佐药。冰片味辛凉，功能清热止痛，为使药0。本方以凉血活血为治疗原则，多药合用，共奏清热解毒、凉血止血、散瘀消肿之功效。
现代文献研究表明，紫草主要成分是萘醌色素类、脂肪酸和多糖等，具有抗炎、抗病源微生物、抗肿瘤等作用；野菊花主要含有挥发油和萜类、黄酮等，具有抗血小板聚集、抗微生物、抗炎及免疫等药理作用M；地肤子主要含有三萜皂苷及甾类化合物、脂肪酸、生物碱等，具有消炎、抗过敏和抗搔痒等作用；侧柏叶含有挥发油、黄酮、鞣质等，具有抑菌、抗肿瘤、抗炎、止血等作用12；冰片主要成分为龙脑香的树脂和挥发油中取得的结晶，为三萜化合物，具有抗菌、抗炎、消肿止痛等作用。
在免疫反应中，IFN-Y主要由Thl细胞分泌，IL-4主要由Th2细胞分泌，而Th1和Th2细胞在正常情况下是处于动态平衡的状态，且分泌的不同细胞因子相互抑制。在接触性皮炎小鼠建模后，外周血中IL4水平明显升高，IFN-Y水平明显降低，消疹止痒喷剂参与治疗后抑制了血清中IL-4水平的升高和IFN-J/水平的降低，推测其作用机制可能是通过上调模型小鼠Th1细胞的功能，抑制Th2细胞的功能，调节IL-4，IFN-Y等细胞因子水平使之保持平衡，从而发挥免疫调节作用。
针对靶向治疗药物导致的皮肤不良反应，目前并无特效药，常予以对症治疗，推荐药物包括皮质激素、四环素等，此类激素、抗生素类药不但会引起严重的不良反应，还会影响原靶向治疗药物的疗效，效果不佳。本实验研究对象“消疹止痒喷剂”为纯中药制剂，价格低廉，临床疗效显着，且无明显毒副作用，值得深入研究。本实验通过皮炎小鼠和瘙痒小鼠模型，验证了本制剂的药理作用，为后期深层次开发应用奠定基础。
作者：陈琳\程宗琦，闫兆威\毛叶勤\陶渊达2(1.苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006；2.南京医科大学药学院，南京210029)
第2篇：止痒药物的药效学学术研究
止痒药物的主要药效学研究是对药物的止痒作用进行实验性评价，目前最常用的评价方法是在瘙痒动物模型上观察单位时间内的瘙痒次数及瘙痒潜伏时间等行为学表现。但瘙痒行为属主观指标，其单独应用难以客观评价药物的止痒效果，常辅以其它指标进行综合评价。现对止痒药物的药效学研究概况作—综述。
1瘙痒动物模型的建立
该模型的建立旨在探讨瘙痒的病理生理机制和研发止痒药物，目前瘙痒动物模型主要有3类：①特定种系的自发瘙痒动物模型。Matsuda等发现NC/Nga种系小鼠皮损与人类特应性皮炎相一致，它可以作为理想的皮炎动物模型用于相关药物研究；MRL/lpr种系小鼠因具有严重的自身免疫性疾病而自发表现出瘙抓行为，它可以作为模拟人类某些自身免疫性疾病伴发瘙痒症状的理想动物模型。②转基因动物瘙痒模型。该模型在研究瘙痒的发生机制方面应用广泛。③致敏物质诱导的瘙痒动物模型。该模型采用单一炎症介质（组胺、5-羟色胺、P物质等）或将其配伍组合，通过皮内或皮下注射引发动物的瘙抓动作，观察并记录单位时间的瘙抓次数；也可通过多种途径方式给予化学物质（如化合物48/80、4-氨基吡啶、右旋糖苷40、二硝基氟苯等）进行致敏，从而引发动物的瘙抓动作。后者在诱发瘙痒的机制和作用效果上优于直接使用外源性炎症介质，且更接近临床，常用于止痒药物的研究。
2主要观测指标
2.1单位时间内瘙痒次数
早在1995年日本富山医药大学kurashi博士研究组就已经制备出小鼠的瘙痒动物模型2，该模型采用皮下、皮内或灌胃给药等方式将致痒物质注入实验动物体内，然后观察记录各实验小组小鼠在建模后一段时间的瘙抓行为。Oliveira等3分别采用化合物48/80和低分子右旋糖苷40作为致痒剂造模，在颈背侧部位注射化合物48/80，以前、后爪挠鼻子和后爪挠注射部位为瘙痒标准，而注射低分子右旋糖苷40则以除了舔舐动作外瘙抓全身作为一次瘙痒记录。瘙痒次数因选择的致痒剂不同或观测者的主观差异性使得瘙痒的标准难于统一。Jiang等4学者在每只实验小鼠后腿皮下植入小磁石，然后放入1个四周环绕着圆形线圈的观察室里观察，利用小鼠瘙抓时后腿动作产生感应电流的原理采用特殊仪器记录，使观测过程更简单、结果更准确，但是对小鼠本身会造成一定伤害。新近发现的SCLABA-Real系统分析方法是一种比较客观简易的无创性记录分析方法，放置在观察笼顶部的高速数字图像采集系统可以同时对4只小鼠的行为进行实时记录分析。实验结束后对药物组、模型组、对照组的瘙痒次数进行统计学处理，可采用单因素方差分析法3，此法可以消除多组间比较时的抽样误差。
2.2瘙抓反应潜伏时间和单次瘙痒持续时间
采用摄像、计时器等仪器分别对药物组和对照组造模后出现瘙痒反应的潜伏时间以及单次瘙抓持续时间进行记录，并进行数据处理分析。这两个指标常结合单位时间内瘙痒次数综合评价受试药物的止痒效果。吴春香等5等在研究地肤子醇提取物止痒效果时就使用上述方法和指标。
2.3致痒剂的致痒阈剂量
采用非定量给予致痒剂的方式造模，以致痒剂使用次数、致痒剂总量等指标作为评价指标，最常采用磷酸组胺诱导的豚鼠瘙痒模型。王雪兰等在研究萑草水提取物止痒作用时先将涂药后的各组豚鼠后肢用细砂纸轻轻擦伤，使之发红，以不出血为度，然后于创面处滴0.25%组胺液，每隔3min滴1次，每次均为005ml/只，直至豚鼠出现舔后足为止，将豚鼠首次出现舔右后足时所给予的组胺总量为致痒阈剂量，以各组动物的止痒阈剂量作为评价药物止痒作用的指标。吴春香等采用该研究方法证实地肤子醇提取物的止痒作用；周然等ra在蛇床子止痒成分R2的一项实验中也采取涂药后于后肢备皮处涂抹磷酸组胺，然后每隔3mn以磷酸组胺浓度递增方式给药直至出现豚鼠回头舔后足，并计算磷酸组胺的总量作为致痒阈剂量。
2.4瘙痒介质的测定
目前有关瘙痒发生的神经生理机制尚未完全阐明，但是国内外在该领域的研究已经取得重大进展。据报道，传导瘙痒的无髓鞘C纤维广泛分布于皮肤真皮与表皮，外源性或内源性因素作用于机体时可产生相应的瘙痒介质，后者与神经末梢上的特异性受体结合而产生痒觉神经冲动。目前已确定的瘙痒介质主要包括胺类、蛋白酶、生长因子、神经肽、类阿片物质、十二烷类细胞素等。瘙痒介质测定是研究药物止痒作用的重要指标。
2.4.1胺类介质胺类介质主要有组胺和5-羟色胺，组胺是目前研究最多的瘙痒介质，组胺在体内主要存在于嗜碱性粒细胞和肥大细胞，当细胞受到免疫性和非免疫因素作用时发生脱颗粒释放组胺，后者与游离神经末梢上的受体发生特异结合而引起痒觉传导，但是它并不是所有疾病的瘙痒介质。致痒剂4-氨基吡啶诱发小鼠舔体反应与刺激肥大细胞脱颗粒释放组胺有关，此模型常被应用于药物止痒机制的探讨。周然等用此模型研究蛇床子的止痒作用，采用荧光法测定各组动物皮肤和血清样本的组胺含量，研究结果显示药物组的组胺含量明显低于对照组并有统计学意义，证实了蛇床子止痒有效成分的作用机理可能与其稳定肥大细胞膜、抑制皮肤肥大细胞脱颗粒释放组胺有关。
2.4.2白细胞介素业已证实白细胞介素IL-2、IL-4、IL-6能引起瘙痒反应，在转基因鼠中高表达IL-4可引发类似人类特异性皮炎的瘙痒性皮肤病。我国学者王晖等采用组胺和4-氨基吡啶联用建立瘙痒动物模型，小鼠眼球取血用试剂盒测定小鼠血清中组胺、INF-y和IL-6的浓度综合作为评判模型优劣的指标之一，结果表明，瘙痒次数多的实验组血清中上述介质浓度显着高于瘙痒次数少的实验组。巫冠中等在探讨黄酮类活性组分的止痒活性时用氯喹给小鼠全身造模后取各组小鼠血清样本，用免疫组化方法测定IL-4含量，结果证实药物组的IL-4的含量低于模型组，且具有统计学意义。
2.4.3其它介质P物质、INF-Y、TNF-a等亦可作为瘙痒介质。P物质是一种含11个氨基酸残基的多聚肽，属于速激肽家族，存在于神经末梢纤维内，与NK-1受体结合而引起痒觉传导。多位学者曾报道，在变应性接触性皮炎（ACD)伴发的瘙痒机制研究中组胺和5-羟色胺可能不起主要作用，P物质通过与神经肽受体结合而发挥生物学效应。在其它类型瘙痒中，C类神经被激活后可导致神经肽P物质的释放，后者加速肥大细胞脱颗粒释放组胺。
2.5病理形态学检查
在瘙痒动物模型观察瘙痒行为之后，立即剪取模型小鼠注射致痒剂周围2cmX2cm大小面积的皮肤，初步去除皮下结缔组织，放入10%的甲醛溶液中固定保存，然后制成常规病理切片。瘙痒反应的病理学改变主要有：局部毛细血管内皮细胞收缩，毛细血管通透性增加以及炎性成分的渗出，炎性细胞的聚集、增生与浸润。
王晖采用组胺和4-氨基吡啶联用建立瘙痒动物模型，在该模型动物皮肤样本中发现以中性粒细胞为主的炎性细胞分布更密集，间质水肿更明显，结合瘙痒反应次数及致痒介质浓度测定结果综合判断，表明联合方案建立的动物模型瘙痒行为更明显。
巫冠中研黄铜类止痒活性，探讨该药物抑制肥大细胞脱颗粒和组胺释放的作用。选用SD小鼠作为实验动物，经腹腔灌洗收集肥大细胞，并按相应的细胞生物学方法经系列处理得到浓缩的单层细胞液，随机收取100个细胞用1%中性红溶液染色，计数其中脱颗粒的肥大细胞。评判的标准包括细胞边缘的完整性消失；细胞颗粒状物的释放。
3超敏反应动物模型在止痒药物研究中的应用
超敏反应动物模型的炎症反应程度可用于评价药物止痒效果，在超敏反应动物模型上测定药物组与对照组的局部肿胀度或单位面积重量作为评价指标。周然等[]将实验组涂药、对照组涂赋形剂后用DNCB(2、4-二硝基氯苯）引发小鼠迟发型超敏反应，各组小鼠以1%DNCB(空白对照组用乙醇）0.1ml均匀涂于脱毛区皮肤致敏，次日起各组背部脱毛区涂抹相应的药物，1次/d，连续5d，于致敏后第5天，各组小鼠以1%DNCB0.1ml均匀涂于右耳内外两侧以激发，24h后脱臼处死，用打孔器取下两耳相同部位相同面积的耳片称重，以左右耳片重量差值为肿胀度，计算出肿胀率，统计结果表明给药组的肿胀率明显低于对照组。王雪兰亦采用该方法探讨萑草水提取物的止痒效果。
4小结与展望
止痒药物药理作用在动物实验研究阶段常以瘙痒行为为主要甚至为唯一指标。但在动物瘙痒行为的观察上因瘙痒行为的标准难于统一导致主观上的误差，同时也有客观上的误差，如以小鼠为实验动物对象，小鼠在安静无刺激因素的状态下出现自发性的瘙痒行为动作也较常见。甚至有的学者建立的动物模型本身就不能很好的模拟人类的瘙痒症状，kuraishi经典的瘙痒模型就不能很好的区分疼痛和瘙痒引起的瘙抓动作。我们总结了评价药物止痒效果的常用方法与指标，具体使用时应以瘙痒动物模型的瘙痒行为记录为基础，再联用其它方法与指标。鉴于瘙痒往往是多因素引起的多种瘙痒介质参与的病理症状，有学者在建立瘙痒动物模型时同时采用几种致痒物质建立动物模型而非单一物质制造的动物模型似乎更合理。
作者：刘曼，孙亭方，王贵林（长江大学医学院，湖北荆州434023)
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