基因类疾病研究教授(下列同基因诊断治疗与人类基因组研究)

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【关键词】 红斑狼疮,系统性;hla抗原;疾病遗传易感性;等位基因

【摘要】 目的 探讨缓解期系统性红斑狼疮(sle)病人所生子女罹患sle的危险性。方法 应用实时定量pcr技术检测14例sle病人、病人子女及18例对照者hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602的频率，免疫印迹法检测入组者ena抗体谱。结果 sle病人组dqa1*0102频率显著高于对照组(rr=2.02,p<0.05)，而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602频率比较差异无显著意义(p>0.05);sle病人组 dqb1*0602频率显著高于其子女组(rr=2.06,p<0.05)，而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102频率比较差异无显著性(p>0.05);sle子女组dqa1*0102频率显著高于对照组(rr=2.14，p<0.05);而两组间drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602频率比较差异无显著性(p>0.05)。sle病人组自身抗体ssa及dsdna出现频率明显高于对照组(p=0.019、0.015)，两组间ssb及ro52差异无显著性(p>0.05); sle病人子女组所测自身抗体检出率为0。结论 hladqa1*0102为sle的易感等位基因，dqa1*0102有一定的遗传倾向。经过系统治疗达到缓解期的sle病人生育的子女罹患sle的危险性无明显增加趋势。

【关键词】 红斑狼疮,系统性;hla抗原;疾病遗传易感性;等位基因

　association of sle patients and their filial generation with slerelated genes and antibodies sun huanxia, su houheng, cui jiajia, et al (department of immunology and rheumatology, qingdao university medical college, qingdao municipal hospital, qingdao 266071, china); [abstract] objective to explore the risk of suffering from systemic lupus erythematosus (sle) in children born by patients with sle at paracmasis. methods the frequencies of hladrb1*1501, drb1*0301, dqa1*0102 and dqb1*0602 alleles of 14 sle patients and their children, and 20 healthy controls were detected by realtime pcr technology and ena antibody repertoire by immunoblotting. results in sle group, the frequency of dqa1*0102 allele was significantly higher than that in the controls (rr=2.02,p<0.05), and no significant differences of frequencies of drb1*1501, drb1*0301, and dqb1*0602 allele were noted between the two groups (p>0.05); the frequency of dqb1*0602 allele in sle patients was significantly higher than that of their children (rr=2.06,p<0.05), and no significant difference was found between them in terms of drb1*1501, drb1*0301, dqa1* 0102 allele (p>0.05). in slechildren group, dqa1*0102 allele frequency was significantly higher than that of the healthy controls (rr=2.14,p<0.05), and the differences of drb1*1501,drb1*0301, and dqb1*0602 allele were not significant between the two groups. the frequencies of autoantibodies ssa and dsdna in sle patients were higher than that of the controls (p=0.019,0.015), and no statistical differences of ssb and ro52 were recorded between the two groups(p>0.05). the detection rate of autoantibody was nil in the patients’ children. conclusion hladqa1*0102 is a susceptible allele with genetic predisposition. the risk of suffering sle in sons or daughters born by sle patients, at catabasis after systematic therapy, is not increased.

　　[key words] iupus erythematosus, systemic; hla antigen; genetic predisposition to disease; allele

　　系统性红斑狼疮(sle)是一种严重危害人类健康的难治性自身免疫性疾病。近年来，随着免疫学、实验室检测技术的发展、微卫星标记和扫描技术的应用以及医生对sle认识的不断提高，sle检出率呈上升趋势。sle虽然好发于20～45岁的育龄女性，但却不影响女性病人的生育能力。如今，大多数sle病人能够成功妊娠并生育健康的孩子[1]，但其子女罹患sle的危险性一直是人们极其关注的问题。大量的研究表明，遗传因素在sle的易感性及其表达方面起着重要作用，其中hladr2、dr3等基因与sle的相关性在很大程度上已被证实。有关sle母亲带有hlaⅱdr2、dr3基因是否增加其子女患sle的危险性，经系统治疗缓解后sle病人生育的子女sle相关基因及自身抗体的研究，国内外报道较少。本研究对2003—2009年在我院住院和门诊就诊的sle病人及其子女进行研究,以探究缓解期sle病人所生子女罹患sle的危险性。现将结果报告如下。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　本文14例sle病人(b组)系无血缘关系的山东汉族sle母亲，均符合1982年美国风湿病协会(acr) 修正的sle诊断标准4 条或4条以上，年龄26～37岁,平均32岁。 14例sle子女均为sle病人经系统性治疗完全缓解后所生子女(c组),年龄1～17岁,平均6岁(其中2例sle病人子女因年龄小血样未采集到，故入组sle子女共12例)。同时，选择同种族同地域健康对照者(a组)18例,年龄 23～37岁, 平均26岁;均排除自身免疫性疾病及其家族史。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 dna抽提 受试者采集外周静脉血2 ml于edta 抗凝管中。采用invitrigen的purelinktm genomic dna提取试剂盒,按操作步骤提取上述实验对象全血dna,置4 ℃保存，备用。

　　1.2.2 pcr 扩增 采用实时定量pcr技术检测所有入组者的hladrb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因。目的基因引物序列见表1，各对引物分别特异性扩增等位基因 hladrb1*1501、dqa1* 0102、dqb1*0602、drb1*0301。另外，设计一对上下游引物βaction作为内参照引物,以检测扩增体系。表1 hladrb1*1501、dqa1* 0102、dqb1*0602、drb1*0301引物序列等位基因引物序列 引物源于cell mol neurobiol[2]，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。

　　pcr反应体系20 μl,各反应体系均含有以下组分：带有rox的platinum sybr green qpcr super mixudg 10 μl，10 μmol/l正向引物(f)1 μl, 10 μmol/l 反向引物(r)1 μl,模板dna2 μl,高压灭菌蒸馏水6 μl。三步循环法pcr 扩增条件: 预先50 ℃ udg 孵育2 min，95 ℃预变性2 min;然后95℃变性15 s，退火温度退火45 s,72 ℃延伸30 s，共进行35个循环，最后4 ℃保存。hladrb1*0301、drb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602基因退火温度分别为56.7 ℃、62.3 ℃、58.4 ℃、62.3 ℃。研究对象部分pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测等位基因扩增情况。

　　1.2.3 自身抗体ena谱的检测 采用免疫印迹法检测所有研究对象自身抗体ena谱。

　　1.3 统计学处理

　　基因频率的计算采用直接计数法,用精确检验四格表资料的fasher确切概率法计算确切概率p值。对基因频率的差异有统计意义的等位基因进一步做疾病相关性分析，计算相对危险度rr。

　　2 结 果

　　2.1 sle病人drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102、dqb1*0602等位基因检测

　　b组病人dqa1*0102等位基因频率显著高于a组(rr=2.02,p<0.05);两组间dqb1*0602、drb1*1501、 drb1*0301等位基因频率比较，差异无显著性(p>0.05)。b组病人dqb1*0602频率显著高于c组，差异有显著性(rr=2.06,p<0.05);而drb1*1501、drb1*0301、dqa1*0102等位基因两组比较差异无显著意义(p>0.05)。c组dqa1*0102等位基因频率显著高于a组(rr=2.14,p<0.05);而其drb1*1501、drb1*0301、 dqb1*0602等位基因两组间比较差异无显著性(p>0.05)。见表2。

　　2.2 各组自身抗体ena谱检测

　　b组自身抗体出现频率均较a、c组高。其中，自身抗体ssa及dsdna出现频率明显高于a组(p=0.019,0.015)，而ssb及ro52频率虽高于a组，但差异无显著性(p>0.05);a组除ssa、ssb、dsdna、ro52等4种自身抗体外，另外5种抗体均未测出。c组所测自身抗体均未测出。各种抗体出现频率和百分率见表3。

　　3 讨 论

　　目前，国内外对sle的研究报道主要集中于不同人种、种族的易感基因及家族同患病例。而同时将sle病人及其经系统治疗达到完全缓解后病人生育的子女，从基因和自身抗体等方面进行研究，探表2 hladrb1、dqa1、dqb1基因与sle的关联情况表3 各组ena谱检测情况(例)抗体究缓解期sle病人所生子女罹患sle的危险性的报道尚属罕见。本实验对sle病人、病人子女从基因及抗体等方面进行研究，探究sle子女罹患sle的危险性。

　　本实验sle相关基因研究结果显示，sle病人dqa1*0102等位基因频率较a组显著增高，差异具有显著性，因此认为dqa1*0102等位基因可能为sle的易感基因，这与国内外dqal*0102对sle有遗传易感倾向的结论相一致[3];b组与a组dqb1*0602等位基因的出现频率比较差异无显著意义，提示无法确定dqb1*0602等位基因是否为sle的风险基因。本实验drb1*1501、drb1*0301等位基因频率b组与a组比较差异无显著意义,而对上海等地区的研究表明，dqa1*0102、dqb1*0602、drb1*1501、drb5*0101为汉族的sle易感基因型。b组dqa1*0102等位基因频率与c组比较差异无显著性，而c组dqa1*0102等位基因频率显著高于a组,这提示sle母亲增加了sle易感等位基因dqa1*0102在其子女中出现的危险性，dqa1*0102有一定的遗传易感性。c组等位基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602与a组比较差异无显著意义，这表明经系统性治疗达到缓解期的sle病人所生育的子女与健康者相比携带sle相关基因drb1*1501、drb1*0301、dqb1*0602的危险无明显增加的趋势。

　　sle的特征是产生大量致病性ena[4]。本实验结果显示，sle病人多种自身抗体同时出现的频率高。其中抗sm抗体和ssb抗体阳性率分别为14.3%、7.1%，较sle病人上述2种抗体阳性率分别为29.6%、15%的报道低[5]，可能与病例数较少有关。抗dsdna抗体具有较高特异性,几乎仅发现于sle病人中。文献报道sle病人抗dsdna抗体阳性率为52.7%[4]，而本实验抗dsdna抗体阳性率为71.4%，可能与入组sle病人病情处于活动期有关。抗dsdna抗体是sle病情活动的指标，抗体效价随病情缓解而下降。本文抗ssa抗体阳性率57.1%，较抗ssa抗体在sle中阳性率35%的报道高[6];很多研究证实抗ssa抗体可造成新生儿狼疮及先天性房室传导阻滞，本文sle病人子女9种自身抗体中的5种均未测出，这从一定程度上说明经系统性治疗达到缓解期的sle病人所生育的子女，虽然有携带sle易感基因的危险，但出现sle自身抗体的概率很低。

　　sle自身抗体与其相关基因有关联。olsen等[7]报道，白种人sle的抗dsdna抗体与hladr3、dr2、dq2、dq6相关;国内文献报道，江苏汉族sle病人抗dsdna抗体与hladrb1*1501、dqa1*0102、dqb1*0602相关，云南汉族sle病人抗dsdna抗体的产生与dqb1*0602相关，与drb1*1501*1502dqa1*0102dqb1*0602单倍型相关，这提示不同种族、地区sle病人自身抗体与hla的关联存在等位基因差异。本实验由于病例数较少,未做自身抗体与基因的相关分析,b组抗dsdna抗体与等位基因dqa1*0102、dqb1*0602检出率均相当高。

　　hladrb1*0301、dqa1*0102以及dqb1*0602均阳性的sle母亲，其所生子代出现自身抗体ssa()、ro52()、ssb(+)、dsdna()、nu(+)的频率高，这提示sle母亲存在多个sle相关基因、多种自身抗体，特别是ssa、ssb、ro52高滴度可能是sle病人子代罹患sle的高度危险因素，这与抗ro/ssa和抗la/ssb抗体与新生儿狼疮高度相关的报道结果相符[8]。buyon[9]的研究也证实，chb病人的母亲血清中均含抗ro抗体和(或)抗la抗体。

　　本实验从hladr、dq基因和ena抗体谱等方面进行分析，结果显示完全缓解期sle病人生育子女罹患sle的危险性无明显增加趋势，与sle病人病情控制稳定后可以安全妊娠的报道相符[10]。但有研究报道7～16岁的sle病人子女的学习无能发病率增加，其中诵读困难最普遍，与诵读困难相关的抗体分别为抗ro/ssa抗体和抗磷脂抗体[11]。因此，收集sle病人所生子女的资料,进行神经功能检测等远期随访是很必要的，但目前这方面的资料尚少见。

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