三七总皂甙与参麦注射液对大鼠脑出血后脑水肿

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【关键词】 三七总皂甙;参麦注射液;脑出血;tnfα;hsp70

【摘要】 目的 比较观察三七总皂苷及参麦注射液对脑出血大鼠脑组织损伤和脑水肿的作用。方法 采用胶原酶与肝素复合法造成大鼠脑出血模型，造模后3 h，各组按试验设计给药，在相应时间点先对大鼠进行神经行为学评分，测定脑组织含水量、细胞形态学的变化，tnfα及hsp70表达。结果 三七、参麦均能够改善神经功能缺失症状,在第4天与模型组比较差异显著(p<0.05)。三七及参麦组能够减轻脑组织水肿，于第4天、第7天改善明显，与模型组比较差异显著(p<0.05)，与甘油作用相似，但起效较慢。三七和参麦均能够使大鼠脑出血后tnfα表达降低、hsp70表达升高，以4 d、7 d与模型组比较有显著性差异(p<0.05)。结论 三七和参麦可以改善脑出血后神经功能缺陷症状;能减轻脑出血后脑水肿;可以抑制脑组织tnfα的表达，增加hsp70表达，疗效优于甘油;综合各指标分析和比较，三七的作用较参麦好。

【关键词】 三七总皂甙;参麦注射液;脑出血;tnfα;hsp70

　对于脑出血治疗的报道多偏于现代医药方面的研究，如甘露醇、甘油等一些脱水药的降颅内压作用是明显和肯定的，但也存在一些不容忽视的副作用。脑出血属于中医学脑卒中范畴，而年老正衰易发瘀血、气血虚弱，应用活血和补气中药治疗缺血性和出血性脑卒中有很好的疗效〔1〕。三七和参麦无论在脑出血的初期还是恢复期，都是临床上使用较多的中药，但同时对二药的疗效、脑水肿、肿瘤坏死因子α(tnfα)、热休克蛋白(hsp70)表达的影响等比较尚未见报道。本研究旨在通过比较观察两者对脑出血大鼠的治疗作用，寻找出治疗脑出血比较有效的中药;为拓展中医药在防治脑出血领域提供理论和实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组与处置

　　健康清洁级雄性sd大鼠104只，体重200～250 g， 随机选8只为假手术组，余96随机分为脑出血模型组、甘复方甘油组、三七总皂甙组、参麦注射液组，并分设48 h、4和7 d三个时间组，每组8只大鼠。

　　1.2 脑出血模型的制备及给药

　　10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔麻醉，将大鼠固定于立体定位仪上，切开头部正中皮肤，暴露颅骨，参考rosenberg的大鼠脑出血模型，按大鼠立体定位图谱定位左侧尾状核,用微量注射器取0.6 μl胶原酶肝素溶液，假手术组除不注胶原酶肝素溶液。造模3 h后，分别给予生理盐水，复方甘油、三七总皂甙及参麦注射液2 ml腹腔注射，假手术组不给药，每日给药1次。

　　1.3 结果测定

　　1.3.1 模型筛选及神经行为学评分

　　大鼠清醒后2 h进行神经功能缺损评定，评分参考zea longa 5分制评分法：0：无神经损伤症状;1分：不能完全伸展对侧前爪;2分：向对侧转圈;3分：向对侧倾斜;4分：不能自发行走，意识丧失。按神经行为学评分选取在1～3分内者作为研究对象，死亡及不符合条件的大鼠予以剔除，并随机补充。

　　1.3.2 脑组织含水量测定

　　在相应时间点将各组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，甲醛固定，快速断头取脑，将脑组织左前块用滤纸吸取表面液体;分析天平称量湿重;电干燥箱105℃烘烤3 d至恒重后称取干重;脑含水量计算公式为：〔(湿重干重)/湿重〕x100%。

　　1.3.3 苏木素伊红(he)染色

　　取各组大鼠左后块脑组织常规石蜡包埋，切片，he 染色，置光镜下观察。

　　1.3.4 免疫组化检测

　　将每组大鼠右前块、右后块脑组织分别用于检测tnfα和hsp70表达，免疫组化法按试剂盒说明进行操作。光镜下tnfα和hsp70阳性细胞的胞浆或胞核内会出现棕黄色的颗粒,每组织块选5张切片，400 视野下，计数8 个(0.25 ×0.25) mm2范围内阳性细胞数。

　　1.4 统计学分析

　　采用spss13.0统计软件，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 神经行为学比较

　　假手术组大鼠未见神经功能缺失症状，其余各组大鼠均出现不同程度的神经功能缺失症状,48 h最重，4、7 d逐渐减轻。甘油、三七、参麦组各时间点均较模型组症状减轻;其中甘油组于造模后48 h、三七、参麦组均于造模后第4天神经功能改善明显，与模型组比较差异显著(p<0.05)。见表1。

　　2.2 脑含水量比较

　　与假手术组比较，其余各组大鼠脑含水量均增加，以48 h最重，后呈下降趋势。甘油组各时相均较模型组含水量少，与模型组比较差异显著(p<0.05);三七及参麦组于造模后4、7 d含水量少，与模型组比较差异显著(p<0.05)。见表2。

　　2.3 形态学比较

　　三七组与参麦组神经细胞变性坏死、细胞周围水肿及脑组织结构疏松程度较甘油组轻，死亡细胞数目较甘油组明显减少，但三七组与参麦组两者程度差不多。

　　2.4 tnfα阳性细胞比较

　　假手术组tnfα阳性细胞数无明显变化，其余各组明显增加，出血后48 h升高的幅度大于出血后4、7 d;三七、参麦组以4、7 d较模型组及甘油组表达降低明显(p<0.05);在7 d时，三七组较参麦组表达明显减少(p<0.05)。见表3。

　　2.5 hsp70阳性细胞比较

　　假手术组hsp70阳性细胞数无明显变化，其余各组明显增加，其中以4 d表达为最高，48 h、7 d表达均较4 d少。三七、参麦组以4 d、7 d较模型组及甘油组表达增多明显(p<0.05);而7 d时，三七组hsp70阳性细胞表达又明显多于参麦组(p<0.05)。见表4。表1 大鼠神经行为学评分表2 大鼠脑组织含水量测定表3 大鼠脑组织tnfα阳性细胞数表达比较表4 大鼠脑组织hsp70阳性细胞数表达比较

　　3 讨 论

　　脑出血属于中医学脑卒中范畴，急性期致病因素以内风、痰浊、瘀血、邪热为主，病邪为害的最终环节为脑络闭阻，致血液运行不畅，形成淤血，瘀血的再生，推动病情的发展,而年老正衰是发病的主要因素，以肝肾阴虚、气血虚弱为发病之本。出血性脑卒中导致的血肿及周围水肿、血液循环障碍，相当于中医的病理瘀血，使得气血津液运行不畅，脑失濡养。治疗上应祛瘀，解除血肿压迫，清除病理代谢产物，补气，以增行血，消散瘀结，滋养脏腑。

　　三七总皂甙具有止血活血双重作用。研究发现，三七能够促进血肿吸收〔2〕，抑制钙超载〔3〕、清除氧自由基、花生四烯酸及炎症因子〔4〕等有害物质，并能修复损伤的血管、改善微循环，增强免疫力等。参麦注射液由人参、麦冬组成，功效为益气养阴固脱。研究发现它能够促进血肿吸收〔5〕，清除氧自由基〔6〕、抑制钙超载及原癌基因〔7〕等有害物质，并能改善血循环，促进脑内蛋白质、神经递质的合成，增强机体免疫力等。两者皆同时具有中医的“祛邪” 与“扶正”功能,但是三七偏于祛邪，参麦注射液偏于扶正，两者作用虽有相同之处，但各有侧重。

　　脑出血致周围血肿组织形成缺血半暗带，在缺血缺氧状态下，众多的炎症因子被启动，释放出tnfα。tnfα是一种糖蛋白，正常水平可抵抗细菌、病毒等的感染，大量产生和释放会破坏机体的免疫平衡，释放白细胞介素(il6)和蛋白水解酶引起氧自由基的生成;促发炎症反应，加重脑水肿〔8〕。脑出血所致的周围缺血半暗带也是hsp70产生的一种应激刺激。hsp70是一族应激蛋白，正常细胞内含量低，在应激状态下升高较为明显，其表达可作为细胞受损可靠的指标，本质是一种自身保护的抗损伤反应。其神经保护机制可能为：介导蛋白质正确装配，维持细胞正常代谢〔9〕;抑制氧自由基;减轻钙超载;阻止细胞启动自杀程序;减少细胞凋亡;抑制内源性一氧化氮合酶(nos)，减轻血管源性水肿〔10〕。

　　本研究提示减轻脑水肿的作用中药较甘油相对慢。tnfα在假手术组仅表达少量，而在模型组表达增加明显，表明在正常脑组织中含量少，其检测可以敏感地反映缺血区神经细胞的变化，适于对药物疗效的评估。在本实验中，三七和参麦注射液都能够显著降低血肿周围缺血区tnfα的表达，在第4天表达增多明显，并且三七较参麦注射液的疗效时间更持久。hsp70在假手术组仅表达少量，而在其他造模组初期表达增加明显，表明在正常脑组织中含量少，脑出血后缺血缺氧可以作为其表达的应激刺激。另外，三七和参麦注射液能够显著增加血肿周围缺血区hsp70的表达，发挥其神经保护作用，并且三七较参麦注射液的疗效更持久,综合各指标分析和比较，偏于“祛瘀”三七总皂甙对脑出血后神经的保护作用较偏于“扶正”参麦注射液好，疗效更持久。在临床上考虑用中药治疗脑出血时，选用三七总皂甙可能更有益。

【参考文献】
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　　9 hartl fu，hayerhartl lar chaperones in the cytosol：from nascent chain to folded protein〔j〕.science,2002;295(5561)：18528.

　　10 孙 琳,刘爱芬,李义召,等.脑缺血再灌注后热休克蛋白70、cfos的表达及柘树制剂的神经保护作用〔j〕.临床神经病学杂志,2005;18(5):3546.

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