首页 > 论文范文 > 医疗卫生

丹酚酸对离体培养内皮祖细胞、表达及

2022-11-05  本文已影响 201人 
中国论文网为大家解读本文的相关内容: 丹酚酸b对离体培养内皮祖细胞vegf、bfgf mrna表达及抗氧化酶活性的影响

【关键词】 丹酚酸b;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶

【摘要】 目的 探讨中药单体丹酚酸b对离体培养内皮祖细胞(epcs)细胞因子mrna表达及抗氧化酶活性的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化epcs,免疫细胞化学法鉴定。选择丹酚酸b最佳药物浓度干预的epcs,采用实时荧光定量pcr(rtpcr)检测细胞vegf,bfgf mrna表达,测定细胞培养液抗氧化酶sod,gshpx的活性。结果 丹酚酸b组vegf,bfgf mrna的表达量增加,与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。丹酚酸b组细胞培养液中sod活性增强,与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05);gshpx活性有增强趋势,但与对照组比较差异无显著性(p>0.05)。 结论 丹酚酸b对epcs具有保护作用,增强其细胞功能的部分机制与其增强分泌细胞因子vegf和bfgf mrna的表达,并且促进细胞释放sod、gshpx,清除自由基能力增强有关。

【关键词】 丹酚酸b;内皮祖细胞;细胞因子;抗氧化酶

 【abstract】 objective to explore the effects of traditional chinese medicine monomer sal b on cytokine mrna expression and activity of antioxidant enzymes of endothelial progenitor cells (epcs) in vitro. methods cultivation and purification of epcs in vitro was by densitygradient centrifugation and plastic adherence method,and identified by immunocytochemistry. epcs were intervened by best concentration of sal b, the expressions of vegf, bfgf mrna were detected by rtpcr, the activity of antioxidant enzymes sod, gshpx activity of cell culture fluid were tested. results vegf, bfgf mrna expression of sal b group were increased, which had statistically significant difference compared with those of control group (p<0.05). sod activity was enhanced of sal b group, which had statistically significant difference compared with that of control group (p<0.05). sal b group strengthened the trend of the activity of gshpx , but there was no significant difference compared with that of control group (p>0.05). conclusions sal b plays a protective role and enhances its cell function on epcs, the part of the mechanism is that enhances the expressions of vegf,bfgf mrna, promotes the cells to release sod, gshpx, and enhances the scavenging capacity of free radical.

  【key words】 sal b; endothelial progenitor cell; cell factor; antioxidant enzymes

  内皮祖细胞(epcs)是血管内皮的前体细胞,参与成体血管新生,是治疗缺血性疾病和改善微环境的良好种子细胞,具有广阔的应用前景〔1〕。前期研究显示活血化瘀中药丹参的主要水溶性成分丹酚酸b(sal b)对epcs具有保护作用,增强其细胞功能〔2〕。本文从细胞因子血管内皮生长因子(vegf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)mrna表达和抗氧化酶超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)入手,观察sal b对离体培养epcs细胞因子mrna表达及抗氧化酶活性的影响。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物

  wistar大鼠,雄性,体质量(120±20) g(中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心,动物许可证号:scxk20050001)。

  1.2 主要仪器和试剂

  ldmem;特级胎牛血清;vegf,bfgf,纤维连接蛋白(r&d);大鼠单个核细胞分离液(天津灏洋生物);cd34兔多克隆抗体,cd133兔多克隆抗体;sal b(天津天士力现代中药资源有限公司,批号20060601)。免疫细胞试剂盒(天津灏阳生物),二氨基联苯胺(dab)(sigma公司);二苯基四氮唑溴盐(mtt)(联星生物),taqman reverse transcription reagents和sybr green pcr master mix reagent kits试剂盒(applied biosystems),trizol总rna提取试剂(天津润泰科技发展有限公司);sod、gshpx生化试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

  co2恒温培养箱(model tc2323 co2 incubator);倒置相差显微镜(xd101 98010),超净化工作台(hitachi),台式高速低温离心机(hermlez323k美国), uv530紫外分光光度计(上海生物仪器厂),pcr仪(美国hybaid),abi7300实时定量pcr仪,细胞培养管(ep管);半自动生化仪(rt9200,成都贝斯达仪器有限公司);hh6数显恒温水浴锅;离心机(ldz52);酶标仪(美国biorad);无菌手术器械;磁力搅拌器;电子天平(bs1101s 德国)。

  1.3 方法

  1.3.1 epcs培养与鉴定

  采用贴壁筛选和密度梯度离心结合法〔1〕:大鼠脱颈处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,dhank液冲洗骨髓,筛网过滤,制成单细胞悬液,按等比例缓慢滴加悬液于大鼠单个核细胞分离液(密度为1.080 g/ml)之上,2 000 r/min,离心15 min,抽取灰白色的单个核细胞层,用dhank′s离心洗涤后,以2.0×105/cm2的密度接种纤维连接蛋白(5 μg/cm2)在包被的培养瓶中,ldmem(含体积分数为15%胎牛血清,15% vegf,15% bfgf),置于37℃,5%co2饱和湿度的培养箱中,4 d后首次换液,继续培养至第7天。选取生长良好的细胞培养至7 d的epcs,用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(sabc)法检测细胞表面抗原cd34、cd133。cd34、cd133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。

  1.3.2 mtt方法检测sal b的最佳药物浓

  度 根据文献报道设立0,0.5,1,2,4,8,16,32,64 μg/ml药物浓度,分别测定细胞的od值,根据od值均数曲线图确定sal b的最佳药物浓度。

  1.3.3 实验分组

  细胞培养第7天后,以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液,以等数量细胞接种于12孔板,随机分为2组:①对照组:ldmem培养液(含15%胎牛血清、15%vegf,15% bfgf); ②实验组:ldmem培养液加入筛选出最佳浓度的sal b,培养24 h,进行检测。

  1.3.4 实时荧光定量pcr(rtpcr)检测细胞vegf,bfgf mrna表达

  1.3.4.1 细胞总rna提取

  ①按试剂盒操作说明,直接将裂解液trizol加入12孔板,每孔1 ml,每组设6个复孔,分别用加样器反复吹打几次,混匀;②将匀浆样品在室温放置10 min,使核酸蛋白复合物完全分解,吸取匀浆样品放于1.5 ml无rnase的离心管中;③每个离心管中加入0.2 ml氯仿,涡旋混合器剧烈震荡15 s,室温放置3 min,令样品萃取分层; ④4℃,12 000 r/min,离心15 min,样品分为三层黄色的有机相,中间层和上层无色的水相,rna主要存在于水相中,将上清水相转移到预冷新管中,约500~600 μl;⑤每管缓慢加入与上清等量的冷异丙醇(-20℃预冷),轻轻混匀,于-20℃静置2 h,使核酸沉淀;⑥4℃,12 000 r/min,离心10 min,弃上清,在管侧壁和管底形成白色胶状沉淀(rna);⑦缓慢沿管壁加入1.2 ml 75%乙醇(depc水配置),洗涤沉淀,4℃,8 000 r/min,离心10 min,弃上清,剩余液体短暂离心,然后用枪头吸出,将沉淀室温放置2~3 min晾干,每管加入35 μl rnase free ddh2o,轻轻吹打数次,溶解rna,分装,备用。

  1.3.4.2 总rna纯度、浓度测定及完整性检验

  取1 μl总rna样品,加入到99 μl去离子水的比色皿中,混匀后紫外分光光度计测定od260、od280以及二者比值。od260/od280比值应在1.8~2.0范围,以此衡量rna纯度。根据公式“od260×40 μg/ml×稀释倍数/1 000”计算总rna浓度。

  另取总rna 4.5 μl与0.5 μl上样缓冲液混合进行1%琼脂糖凝胶电泳,应用bio imaging system拍照,于凝胶成像系统中观察电泳结果,以出现28 s、18 s和5 s三条带确定rna的完整性。

  1.3.4.3 cdna合成

  根据试剂盒说明确定反应体系如下:总反应体系10 μl,10×taq man rt buffer 1.0 μl;25 mmol/l mgcl2 2.2 μl;deoxyntps mixture 2.0 μl;random hexamersb 0.5 μl;rnase inhibitor 0.2 μl;multiscribetm reverse transcriptase 0.25 μl;样品总rna 0.2 μg;反转录反应条件:70℃ 5 min,42℃ 60 min,70℃ 10 min,终止反应。

  1.3.4.4 目的基因vegf,bfgf及内参照基因βactin扩增 ①pcr扩增:在pcr仪中,bfgf、vegf反应条件为:94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共32个循环;再于72℃延伸7 min。各目的基因及内参照基因特异性引物序列,βactin反应条件为:94℃ 5 min预变性后;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共28个循环;再于72℃延伸7 min。总反应体系为50 μl,包括cdna 3 μl,1 mmol/l dntps 10 μl,10×taq聚合酶buffer 5 μl,目的基因和βactin上下游引物各2 μl(10 pmol/l),mg2+3 μl,去离子水24 μl,taq酶1 μl。引物序列见表1。②所得ct值经转换后以2-δδct相对定量法获得每个样本各目的基因相对表达量数值。表1 各目的基因及内参照基因引物序列

  1.3.5 细胞培养液抗氧化酶的测定

  两组epcs培养于12孔板中,培养条件同前,7 d后收集培养液,每组取6孔样本,2 000 r/min,离心10 min,取上清,比色分析法测定培养液sod和gshpx活性,操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

  1.4 统计学分析

  使用spss11.5统计软件,数据以x±s表示,采用两独立样本t检验。

  2 结 果

  2.1 sal b最佳药物浓度

  确定sal b的最佳药物浓度为8 μg/ml,此剂量可使细胞生长状态最佳,细胞活力最强。见表2。表2 不同浓度sal b作用于epcs后细胞的吸光度值

  2.2 sal b对epcs vegf,bfgf mrna表达的影响

  sal b组vegf,bfgf mrna的表达量增加,与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。见表3。表3 两组vegf,bfgf mrna相对表达量的比较

  2.3 sal b对epcs培养液sod,gshpx活性的影响

  sal b组细胞培养液中sod活性增强,与对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05);而gshpx活性有增强趋势,但与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。见表4。表4 两组细胞培养液sod,gshpx活性的比较

  3 讨 论

  epc可在生理和病理状态下被招募到目的部位,通过血管生成和血管形成机制分化为血管内皮细胞,从而更新和修复衰老或受损的内皮细胞。在机体缺血、组织损伤和细胞因子(或药物)刺激下,epc可从骨髓向靶部位动员、分化及增生,形成新生血管〔3〕。外周血循环中epcs的数量与功能决定着损伤血管的内皮修复程度。

  vegf刺激内皮增殖、增强血管通透性,bfgf刺激内皮细胞、smc和成纤维细胞增生,二者作为血管内皮细胞生长刺激因子,可以协同特异性地作用于血管内皮细胞,刺激其增殖,促进侧支血管的形成,从而改善组织器官的血液供应,对抗组织缺血〔4~6〕。在保护细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中,细胞内sod和gshpx等具有抗氧化酶的作用〔7〕。氧化应激能引起epcs数量减少和功能减弱。虽然epcs存在抗氧化酶系统,但是当细胞正常的氧化还原稳态失衡时,ros过度产生而聚积,引起氧化应激,使dna、蛋白质、碳水化合物和脂质等生物大分子被氧化,导致细胞的衰老和凋亡〔8〕。丹参是活血化瘀中药,具有活血通经功效,其主要水溶性成分sal b可促进恢复受损内皮的功能,在治疗心血管疾病等方面发挥着重要作用〔9〕。研究显示最佳药物浓度的sal b(8 μg/ml)作用于epcs提高了其分泌细胞因子vegf和bfgf mrna的表达,并且促进了细胞释放sod,gshpx,清除自由基能力增强,说明sal b具有抗氧化损伤的作用,对epc具有保护作用,增强其细胞功能的部分机制与此相关。同时该实验结果也可为体外扩增epcs而进行在体实验提供了依据。

【参考文献】
 1 袁 彬,何胜虎 内皮祖细胞移植治疗冠心病研究进展〔j〕.心血管病学进展,2009;30(1):1314.

  2 李庆雯,南亚昀,姜希娟,等.丹酚酸b对离体内皮祖细胞黏附、趋化和增殖的影响〔j〕.天津中医药大学学报,2009;28(1):204.

  3 余 毅,谢福安,周丽娜.内皮祖细胞在缺血性疾病中的研究进展〔j〕.世界临床药物 2009;30(5):2926.

  4 kalka c,tehrani h,laudenberg b,et gene transfer mobilizes endothelial progenitor cells in patients with inoperable coronary disease〔j〕.ann thorac surg,2005;70(3):829.

  5 buehler a,martire a,strohm c,et enesisindependent cardioprotection in fgf1 transgenic mice〔j〕.cardiovasc res,2002;55(4):76877.

  6 hoffmann s,friedrichs u,eichler w,et ed glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation,matrix metalloproteinase2 and vegf upregulation in vitro〔j〕.graefes arch clin exp ophthalmol,2002;240(12):9961002.

  7 王友明,王拥军.抗氧化剂与动脉粥样硬化形成的研究进展〔j〕.中国脑卒中杂志,2007;2(2):15964.

  8 papaharalambusca c,griendling mechanisms of oxidative stress and reactive oxygen species in cardiovascular injury〔j〕.trends cardiovasc med,2007;17(2):484.

  9 范英昌,赵桂峰,张文治.丹酚酸b对大鼠心肌梗死过程中病理形态学的影响〔j〕.天津中医学院学报,2004;23(1):124.

  中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。 返回医疗卫生列表

展开剩余(
口腔医学教学内容(口腔内科学重点笔记)上一篇: 返回列表下一篇:

继续阅读

热门标签