从肝气郁结到肿瘤只需6步(肝郁气滞能变成肝癌吗)

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健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/mapk通路的影响

【关键词】 健脾化瘀方；rtpcr；ras/mapk

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【摘要】 　　目的 研究健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/mapk信号通路相关基因表达的影响。方法 采用rtpcr法，用凝胶电泳分析系统比较目的基因与βactin基因的吸光度比值来反映基因的表达。结果 erk、sos1、cfos基因表达降低(p＜0.05)， mek、raf、ras、grb2基因的表达未见明显差异(p＞0.05)。结论 健脾化瘀方能通过抑制ras/mapk信号通路的上erk、sos1、cfos的表达，从而起到抑制肝癌细胞的生长，诱导细胞凋亡的作用。

【关键词】 健脾化瘀方；rtpcr；ras/mapk

　　effect of jianpi huayu recipe on ras/mapk pathway of human hepatoma cell

　　zou xi,wang ruiping,zhao jiang

　　(jiangsu province hospital of tcm,nanjing university of tcm,nanjing jiangsu,china 210029)

　　【abstract】objective to study the effect of jianpi huayu recipe on ras/mapk signaling pathway of human hepatoma s the gene expression was represented by absorbance ratio of target gene and βactin gene with rtpcr method and gel electrophoresis analysis s erk,sos1,cfos gene expression were lower, while there was no significant difference in mek,raf,ras,grb2 gene sion the jianpi huayu recipe can inhibits the growth of the human hepatoma cell and induce the apoptosis by inhibiting the expression of gene erk,sos1,cfos of the ras/mapk signaling pathway.

　　【key words】jianpi huayu fang;rtpcr;ras/mapk

　　细胞外刺激引起细胞反应是通过细胞内信号传导途径来实现的。k是一类特殊细胞信号传导蛋白，经上游激酶作用后发生苏氨酸、丝氨酸双位点磷酸化而激活［1］。是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者［2］，参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡以及细胞间同步功能等多种细胞过程。该信号传导通路基本的信号传递步骤遵循mapks的三级酶促级联反应，该通路的激活可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡［3］。mapk信号转导通路也被认为是许多信号通路的共同通道［4］。我们的前期实验研究表明，健脾化瘀方能明显抑制人肝癌细胞smmc7721的增殖，诱导人肝癌细胞的凋亡，因此，研究健脾化瘀方对人肝癌细胞ras/mapk信号通路相关基因表达的影响，是探索健脾化瘀方治疗肝癌机制的有效手段之一。本实验主要观察健脾化瘀方对ras/mapk信号传导通路上相关基因表达的影响。

　　资料与方法

　　1.细胞及药物

　　人肝癌细胞株smmc7721由南京中医药大学细胞实验室提供。中药制备：黄芪10 g、白术4 g、苡仁10 g、茵陈5 g、半枝莲5 g、重楼5 g、丹参5 g、郁金5 g、白芍5 g、全蝎1 g，共55 g，用550 ml蒸馏水加热回流提取2次，每次1小时，合并提取的药液，微波真空干燥。配制成相当于生药浓度1 g/ml的药液灭菌备用，实验时配制为6 mg/ml浓度。

　　2.实验方法

　　(1)细胞准备：取处于对数生长期的人肝癌细胞smmc7721，以5×105个/ml密度接种于直径6 cm的培养皿中，37℃、5%co2培养箱中培养24 h以使细胞贴壁，弃原培养液，加入健脾化瘀方终浓度为6 mg/ml的含10%小牛血清的dmem培养液，继续培养48 h后，用pbs洗2次，每皿加1 ml trizol，反复吹打后收集细胞于ep管中。立即使用或-70℃保存待用。以对数生长期肝癌细胞smmc7721为对照。

　　(2)rna制备：每皿1 ml trizol提取的细胞后，每ml加入200 μl氯仿，静置10 min后离心，取上清移至新ep管，加入等体积异丙醇，室温放置 10 min后离心，弃上清沉淀即总rna。每管加入1 ml 75%乙醇（用depc处理过的水配制），离心5 min倒掉乙醇，室温晾干，加入20 μl depc处理水，吹打混匀，随即使用或-70℃保存待用。

　　(3)rna质量鉴定：取2 μl rna加入500 μl depc水中，在紫外分光光度仪上测定rna样品在260 nm和280 nm处的吸光度(od)值。od260与od280比值在1.8～2.0之间，表明无rna降解。2%琼脂糖凝胶40～60 v预电泳10　min后，60 v电压电泳至溴酚蓝迁移到凝胶的3/4处;紫外灯下观察18 s和28 s带情况，可见28 s的宽度及亮度约是18 s的两倍，边缘清晰，表明完整性较好，可用于rtpcr。

　　(4)逆转录：采用takara逆转录试剂盒，按照说明书操作。37℃孵育15 min，85℃ 5 s灭活反转录酶，4℃ 结束，取出低温保存。

　　(5)聚合酶链式反应：采用takara pcr试剂盒，按照说明书操作。扩增条件：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环32次（sos1：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环32次）。rtpcr引物设计见表1。表1 rtpcr实验引物设计（略）

　　(6)电泳凝胶分析：2%琼脂糖凝胶电泳，电压55 v，时间35 min。采用tanon gis2010凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶进行吸光度扫描，测量条带的灰度强弱。结果以目的基因和βactin的积分吸光度比值表示。以上实验均重复3次。

　　3.统计学分析

　　统计分析采用spss13.0软件包进行数据处理，所有数据均用均数±标准差（-±s）表示，采用t检验，以p＜0.05为有统计学意义。

　　结果

　　健脾化瘀方对人肝癌细胞株smmc7721作用48 h后，通过rtpcr和凝胶电泳，利用凝胶电泳成像分析系统扫描条带的积分吸光度值，并与同管扩增的βactin条带积分吸光度做比值，代表基因表达的量。实验结果为：erk、sos1、cfos基因表达较对照组低，erk、sos1各浓度组与对照组比较差异有显著的统计学意义（p＜0.01），cfos高浓度组与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05)；见表2。mek、raf、ras、grb2基因的表达与对照组比较，差异无统计学意义（p＞0.05）。凝胶电泳图见图1。表2 健脾化瘀方作用肝癌细胞后相关基因产物凝胶电泳条带吸光度比值（略）

　　讨论

　　mapk经典的信号转导过程包括：细胞外信号→酪氨酸蛋白激酶受体（receptor protein tyrosine kinase，rptk/rtk）→含有sh2结构域（scr homology 2 domain）的接头蛋白（如grb2）→鸟嘌呤核苷酸释放因子（如son of sevenless，sos）→ras蛋白→丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mapkkk，如raf）→丝裂原活化蛋白激酶激酶（mapkk，如mek1/2）→mapk（如erk1/2）→转录因子→dna合成。mapk 家族包括erk、jnk和p38mapk。其中erk在mapk途径中不仅作为转录因子， 而且是膜蛋白。erk的激活使转录因子磷酸化来调节基因的表达， 促进细胞增殖， 阻止细胞凋亡。当细胞受到外界刺激后，可通过激活erk激酶1( mekl)，进而使erk1/2磷酸化活化，使之由胞浆转位到核内，激活其下游底物，主要是介导一些编码核转录因子的早期反应基因(如原癌基因cfos,cmyc,cjun和erg1等)的活化调控细胞生长反应。导致次级反应基因(如anf基因、mhc基因、mlc2基因等)的异常表达，影响细胞的功能。

　　sos属于gef(鸟苷酸交换因子)家族成员，sos具有双重功能:一是作为接头蛋白,以自身的富含脯氨酸(pro或p)结构域与grb2的sh3区结合,使sos活化；二是具有催化功能,使其下游分子小g蛋白ras激活。活化的ras再作用于下游靶蛋白raf,使之活化(即磷酸化)。raf即mapkk激酶或mapkkk,它是mapk级联反应的第一个分子,从而启动了mapk的三级级联激活。

　　cfos基因属于即时早期基因(immediate early gene)在细胞生长的静止期基本不表达，外界因素如血清egf,pdgf,tgf,tnfa等均可诱导cfos的表达。研究显示cfos基因与肿瘤发生密切相关［5,6］。在肝内胆管癌形成过程中，cfos蛋白表达逐渐增高，在肝内胆管癌组织中cfos蛋白表达最强。提示cfos蛋白高表达与肝内胆管癌发生发展密切相关，cfos基因的激活可能是肝内胆管癌发生的早期分子事件，并参与癌变的全过程。

　　本实验研究表明，健脾化瘀方作用人肝癌细胞株smmc7721后，erk、sos1、cfos基因的表达下降，表明健脾化瘀方可能通过抑制ras/mapk信号通路的上erk、sos1、cfos的表达，从而起到抑制肝癌细胞的生长，诱导细胞凋亡的作用。

【参考文献】
　　［1］rosen lb， stimulation of growth factor receptor signal transduction by activation of voltage sensitive calcium channels［j］.proc-natl-acad-sci usa，1996，93:1113-1118.

　　［2］farnsworth cl,freshney nw,rosen lb,et m activation of ras mediated by neuronal exchange factor ras-grf［j］.nature，1995，376:525-527.

　　［3］klemke rl，cai s，ginanini al，et tion of cell motility by mitogen-activated protein kinase［j］.j cell biol,1997,137(2):481-92.

　　［4］曹亚.细胞周期与肿瘤［j］.国外医学.生理病理科学与临床分册，2002，22:103-105.

　　［5］willing ae,berthoud c distension-induced c-fos expression in catecholaminergic neurons of rat dorsal vagal complex［j］.am j physiol，1997,746(1-2):195-206.

　　［6］柏素云，李冠武，张立民，等.ras/mapk通路在食管癌中的活化改变及其意义［j］.国际检验医学杂志，2006,27(9):771-773.

作者：邹玺 ，王瑞平，赵江作者单位：江苏省中医院肿瘤科，江苏南京 210029；南京中医药大学，江苏南京 210029

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