首页 > 论文范文 > 医疗卫生

在大肠杆菌中表达和纯化蛋白(在大肠杆菌表达系统中,表达分泌蛋白)

2022-11-05  本文已影响 487人 
中国论文网为大家解读本文的相关内容: cggbp1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化
【关键词】 cggbp1;基因表达;纯化


  0引言

  脆性x综合征(fragile x syndrome, fxs)是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征,有超过99%的fxs是由脆性x智障基因1(fragile x mental retardation, fmr1)中5′端非编码区cgg三核苷酸重复序列不稳定扩增及其cpg岛异常甲基化导致. fmr1基因的表达产物fmrp的缺乏导致fxs的发生[1-2]. 本实验对编码基因存在于3号染色体[3],能与fmr1 基因5′ d (cgg)n3′重复序列特异性结合的蛋白cggbp1进行原核表达,并对其dna结合活性进行研究.

  1材料和方法

  1.1材料

  大肠杆菌dh5α, bl21( de3)和表达载体prset a均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自sigma公司; 限制性内切酶bamh i和kpni购自宝生物工程公司;t4 dna连接酶购自promega公司; ni2+nta金属螯合蛋白质纯化系统购自qiagen公司;链酶亲和素磁珠购自dynal公司;低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.

  1.2方法

  1.2.1表达载体的构建

  根据cggbp1基因起始密码子和终止子邻近序列设计pcr引物:cggbp1f cgc gga tcc gag cga ttg tag taa cag ca,cggbp1r ggg gta cct caa caa tct tgt gag ttg ag. 其上游及下游引物分别加入bamhi和kpni酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). pcr反应以人淋巴细胞cdna文库为模板,扩增编码cggbp1的基因序列. 设计pcr扩增体系25 μl,灭菌去离子水10 μl,10×反应缓冲液2.5 μl,25 mmol/l mgcl2 2.0 μl,dmso 2.5 μl,4× dntp混合物(每种2.5 mmol/l)2 μl,cggbp1f和cggbp1r各10 pmol,模板3.5 μl(50 ng/μl), taq dna(5 μ/μl)聚合酶0.5 μl. 扩增条件:95℃预变性5 min,再94℃ 30 s, 53℃ 1 min,72℃ 1 min循环40次,最后72℃终末延伸产物10 min. pcr产物经琼脂糖电泳分离,用胶回试剂盒回收目的基因. 用bamhi和kpni酶切pcr产物和prset a,酶切产物电泳后回收,在t4连接酶作用下,目的片段定向克隆至prset a的bamhi和kpni克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌dh5α,接种到含氨苄青霉素的lb培养基平板并挑取单菌落.

  1.2.2融合蛋白的诱导表达

  将测序正确的重组质粒转入bl21( de3). 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/l氨苄青霉素的lb培养基中, 37℃振荡培养12 h, 按10 ml/l比例转接于新鲜培养基,37℃振荡培养至对数生长期时,加入iptg至终浓度1 mmol/l,32℃诱导振荡培养4 h,离心收集菌体,sdspage分析重组蛋白的表达.

  1.2.3蛋白表达形式的分析

  取5 ml菌液离心,用500 μl的裂解液(10 mmol/l 咪唑,300 mmol/l nacl及50 mmol/l磷酸二氢钠 ph 8.0)重悬,加溶菌酶至终浓度为1 mg/ml,冰浴30 min,超声波裂菌,离心后分别将上清和沉淀进行sdspage分析.

  1.2.4融合蛋白的纯化

  将1 ml 500 ml/l ni2+nta悬液和4 ml细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min,直接过柱. 过柱结束后,用4 ml漂洗液(20 mmol/l 咪唑,300 mmol/l nacl及50 mmol/l 磷酸二氢钠 ph 8.0),洗脱未和ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 ml洗脱液(250 mmol/l 咪唑,300 mmol/l nacl及50 mmol/l 磷酸二氢钠 ph 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白,分步收集. 取收集液,进行sdspage分析.

  1.2.5cggbp1与(cgg)29重复序列双链dna结合

  实验取10 μl磁珠用1 ml的无rna酶的三蒸水清洗磁珠2次,除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液(10 mmol/l trishcl,2 mol/l nacl,1 mmol/l edta,1 g/l tween 20)15 μl重悬磁珠,各5 μl分3组实验. 其中一组加入25 μl(100 ng/μl)生物素化的(cgg)29重复序列双链dna,另外两组分别加入25 μl(100 ng/μl)非生物素化的(cgg)29重复序列双链dna和25 μl三蒸水做对照;三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μl,25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后,弃上清. 重复上述步骤3次;加入纯化后cggbp1(500 μg/ml)15 μl 和2×核酸蛋白结合缓冲液(20 mmol/l hepes,100 mmol/l nacl,0.5 mmol/l dtt,100 g/l甘油)20 μl,室温下静置30 min;经磁力吸附后,弃上清;用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次;加三蒸水10 μl,沸水煮10 min,进行sdspage分析.

  2结果

  2.1原核表达载体的构建及鉴定

  扩增产物在15 g/l的琼脂糖凝胶电泳,可观察到一条约504 bp的条带(图1); 重组质粒prset a/cggbp1及质粒prset a分别用bamhi和kpni酶切,prset a/cggbp1分为两个片段,分别为2.9 ku和504 bp(图2),均与预计结果相同.


  2.2cggbp1的表达

  用bamhi和kpni双酶切prset a/cggbp1表达质粒,筛选阳性重组质粒. 携带有prset a/cggbp1质粒的 bl21(de3)菌株,经iptg诱导后,在mr 约25 000处出现1条表达条带;而未经iptg诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解,离心后分为上清和沉淀两部分. 经sdspage分析表明,cggbp1部分存在于细菌裂解液的上清中,为可溶性蛋白,上清液中的目标蛋白相对较少(图3).

  2.3cggbp1蛋白纯化

  在表达质粒prset a多克隆酶切位点的上游, 插入有连续6个组氨酸的序列 —(his )6 tag. 重组质粒经诱导表达后,(his )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(his )6 tag 和金属ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法,是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. sdspage显示,cggbp1得到较高程度的纯化(图4).

  2.4cggbp1与5′d(cgg)293′重复序列

  双链dna结合实验生物素化的5′d(cgg)29 3′重复序列双链dna被固定到链酶亲和素磁珠上,非生物素化的5′d(cgg)293′重复序列双链dna因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理,加入cggbp1后,未和5′d (cgg)293′重复序列双链dna结合的蛋白也被洗脱(图5).

  3讨论

  关于微卫星的产生机制,普遍认为是dna复制过程中dna聚合酶的滑动[4],或dna复制和修复时滑动链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列,通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域,这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体rna基因中非常复杂,同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合,成为“染色质折叠密码”[5-6],参与遗传物质的结构改变,基因调控及细胞分化等过程. 脆性x综合征是igarashi等[7]研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和(cgg)n重复序列发生特异性结合,而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合[8]. 因此,对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.
  
  本实验成功地构建了含cggbp1的重组质粒,以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过ni2+nta柱纯化,获得纯化的目标融合蛋白质,同时证明了该蛋白能和人fmr1基因5′d (cgg)293′重复序列双链dna特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白cggbp1功能的研究和阐释cgg三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.

【参考文献】

 [1]wells rd, warren st. genetic instabilities and hereditary neurological disorders [m]. academic press, san diego,1998:46-96.

  [2]cleary jd, nichol k, wang yh, et al. evidence of cisacting factors in replicationmediated trinucleotide repeat instability in primate cells[j]. nat genet, 2002, 31(1):37-46.

  [3]deissler h, wilm m, genc b, et al. rapid protein sequencing by tandem mass spectrometry and cdna cloning of cggbp1[j].biol chem, 1997,272(27):16761-16768.

  [4]sinden rr, potaman vn, oussatcheva ea, et al. triplet repeat dna structures and human genetic disease: dynamic mutations from dynamic dna [j]. bioscience, 2002,27(1 suppl 1):53-65.

  [5]wahls wp. meiotic recombination hot spots: shapping the genome and insight into hypervariable minisatellite dna change[j].curr top dev bio1, 1998,37:37-75.

  [6]wahls wp, moore pd. recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite dna requires minisatellite dna binding proteins[j].somat cell mol genet, 1998,24(1):41-51.

  [7]igarashi s, tsuji s. the molecular mechanisms of the instability of the cag repeat[j]. nippon rinsho,1998,56(4):1064-1073.

  [8]deissler h, behnkrappa a, doerfler w. purification of nuclear proteins from human hela cells that bind specifically to the unstable tandem repeat (cgg)n in the human fmr1 gene[j]. biol chem, 1996,271(8):4327-4334.

  中国论文网(www.lunwen.net.cn)免费学术期刊论文发表,目录,论文查重入口,本科毕业论文怎么写,职称论文范文,论文摘要,论文文献资料,毕业论文格式,论文检测降重服务。 返回医疗卫生列表

展开剩余(
乙肝患者胆囊炎(胆汁淤积型乙型病毒性肝炎)上一篇: 返回列表下一篇:

继续阅读

热门标签