【摘要】 目的 探讨生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，ghsr）内源性激动剂生长激素释放肽ghrelin对小鼠结肠动力的影响。方法 小鼠按随机数字法分组后，分别注射生理盐水和不同剂量ghrelin（20，50，100，200 ng/g），用炭末推进实验的方法观察ghrelin对小鼠结肠推进的影响，研究阿托品、ng-硝基精氨酸甲酯和d-lys3-ghrp-6（ghsr阻断剂）对ghrelin（100 ng/g）引起的小鼠结肠推进改变的影响。将小鼠近端结肠环形平滑肌条安置在恒温灌流肌槽中并用smup-e生物信号处理系统记录肌条的自发收缩活动，观察不同浓度的ghrelin（0.01、0.1、1和10 μmol/l）对肌条自发收缩幅度的影响。结果 ghrelin能显著提高小鼠的结肠推进速度，有明显的量效关系。阿托品、ng-硝基精氨酸甲酯、d-lys3-ghrp-6均能显著抑制ghrelin促进结肠推进的作用（t=10.230，12.560，11.590，p＜0.05）。ghrelin能显著增加小鼠近端结肠环形平滑肌的自发收缩幅度，河豚毒素预处理肌条后ghrelin不能显著增加肌条的自发收缩幅度。结论 ghrelin可以显著增加小鼠结肠的推进，可能是通过结肠肌间神经丛的硝基能神经和胆碱能神经上的ghsr而起作用。
【关键词】 ghrelin； 生长激素促分泌素受体； 结肠动力
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（30400429）
effects of ghrelin on colonic motility in mice
qiu wen-cai, wang wei-gang, yan jun, wang zhi-gang, zheng qi.
department of general surgery, sixth affiliated hospital, medical school of jiaotong university, shanghai 200233, china
【abstract】 objective to investigate the effects of ghrelin on colonic motility in mice. methods the effects of ghrelin on colonic propulsive movement were detected by charcoal suspension pushing test after injection of normal saline and different doses of ghrelin （20, 50, 100, 200 ng/g）. the effects of atropine, ng-nitro-l-arginine methylester hydrochloride （l-name） or d-lys3-ghrp-6 on the changes of colonic propulsive movement caused by ghrelin（100 ng/g） were also investigated. in vitro, the effects of different doses of ghrelin （0.01, 0.1, 1, 10 μmol/l） on the spontaneous contraction amplitude of proximal colonic circular muscle strips were studied. results ghrelin significantly accelerated the colonic propulsive movement in dose-dependent manner, but the effect was significantly inhibited in the presence of atropine, l-name or d-lys3-ghrp-6 （t=10.230, 12.560, 11.590, p<0.05）. administration of ghrelin significantly increased the contraction amplitude of colonic circular muscle strips, but this effect was inhibited when the colonic circular muscle strips were pretreated by tetrodotoxin. conclusionsghrelin can accelerate colonic propulsive movement by activating growth hormone secretagogue receptor of cholinergic excitatory pathways and nitrergic nervous pathways in the enteric nervous system of colon.
【key words】 ghrelin; growth hormone secretagogue receptor; colonic propulsive movement
生长激素释放肽ghrelin是1999年kojima等发现的第一个生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，ghsr）的内源性配体。elin与ghsr结合后除了可以促进生长激素的释放外，还具有调节胃肠运动、心血管功能、能量代谢平衡、肿瘤细胞的增生和免疫系统功能等多种作用。我们研究给予小鼠不同剂量ghrelin后结肠推进的变化，并观察不同浓度ghrelin对小鼠近端结肠离体环形平滑肌条自发收缩活动的影响，从而探讨ghrelin对小鼠结肠动力的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和材料
实验用c57小鼠，雌雄不限，体质量（25±5）g，购自上海中国科学院实验动物中心。ghrelin、硝基能神经阻断剂ng-硝基精氨酸甲酯（ng-nitro-l-arginine methylester，l-name）和ghsr阻断剂d-lys3-ghrp-6购自美国tocris公司；胆碱能神经阻断剂阿托品、钠离子通道阻断剂河豚毒素（tetrodotoxin，ttx）购自美国sigma公司。小鼠结肠推进试验及离体肌条试验均在上海交通大学医学院生理学教研室完成。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组和药物注射：48只小鼠禁食、自由饮水24 h后， 按随机数字法分为8组， 每组6只。向各组小鼠腹腔内注射生理盐水，ghrelin 20、50、100、200 ng/g，ghrelin 100 ng/g+阿托品1 μg/g、ghrelin 100 ng/g+l-name 50 μg/g、ghrelin 100 ng/g+d-lys3-ghrp-65nmol/g。后3组的阿托品、l-name和d-lys3-ghrp-6均在注射ghrelin100ng/g前20 min注射。
1.2.2 小鼠结肠推进：结肠推进实验根据文献［1］进行制备，在紧靠回盲部的近端结肠内注入100 g/l活性炭悬液0.2 ml。1 h后小鼠颈椎脱臼法处死，立刻取出全部结肠，测量结肠中炭末推进距离及结肠全长，结肠推进率=（炭末推进距离/结肠全长）×100%。
1.2.3 小鼠近端结肠环形平滑肌条自发收缩活动：将小鼠断颈处死，平铺于实验台上，沿腹中线开腹取出近端结肠，放入台氏缓冲液中清洗后，移入氧饱和的台氏缓冲液中，在显微解剖镜下仔细去除黏膜层，显露肌层，沿环行肌走向剪取2.0 mm×8.0 mm的肌条，置于含有95% o2和5% co2饱和台氏液的垂直灌流槽内，灌流槽内的液体通过恒温装置使温度保持在（37.0±0.5）℃。肌条一端固定于玻璃小钩上，另一端与smup-e生物信号处理系统连接的张力换能器相连，记录肌条自发收缩活动。肌条自发收缩活动平稳后灌流槽内分别通入不同浓度的ghrelin（0.01，0.1，1和10 μmol/l）。ttx阻断神经效应实验是灌流肌槽内预先通入ttx孵育后再同时通入ttx和ghrelin，观察神经效应被阻断时ghrelin对肌条自发收缩活动影响有无变化。更换药物浓度或药物种类时，用台氏液充分冲洗，待肌条自发收缩活动平稳后，再加入下一组浓度或下一种药物。
1.3 统计学分析
结肠推进率以炭末推进距离占结肠全长的百分比计算，近端结肠环行肌条加药后收缩幅度变化以不加药物情况下肌条自发收缩活动稳定后的收缩幅度为对照表示。所有统计数据用x±s表示。实验结果采用同体对照的t检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ghrelin对小鼠结肠推进的影响
与生理盐水组小鼠结肠推进率（39.70±1.78）%相比较，ghrelin注射剂量为50、100、200 ng/g时小鼠结肠推进率均显著提高，分别为（45.10±1.21）%、（52.30±2.51）%、（60.3±1.92）%（t=6.470，11.230，19.230，p<0.05）。ghrelin注射剂量在20 ng/g时小鼠结肠推进率为（40.30±2.11）%，与生理盐水组比较差异无统计学意义。
阿托品1 μg/g、 l-name 50 μg/g和d-lys3-ghrp-65 nmol/g预先处理小鼠均能显著抑制ghrelin 100 ng/g促结肠推进的作用，小鼠结肠推进率分别减少为（42.10±1.35）%、（43.70±1.92）%和（42.30±1.63）%（t=10.230，12.560，11.590，p<0.05）。
2.2 ghrelin对离体平滑肌肌条的影响
在肌条出现稳定的自发性收缩后，分别给予0.1、1和10 μmol/l的ghrelin均可显著增加小鼠近端结肠环行肌条的自发收缩幅度，分别为（112.00±2.31）%、（121.00±1.72）%和（130.00±1.29）%（t=5.320，8.450，11.340，p<0.05）。ghrelin在浓度为0.01 μmol/l引起的肌条自发收缩幅度为（102.00±3.12）%，与自发收缩幅度比较差异不大。在预先用0.2 μmol/l ttx预处理肌条后，各浓度ghrelin均不能显著增加肌条的自发收缩幅度。
3 讨论
ghrelin分布于人体多种组织器官，以胃组织中含量最高，说明ghrelin在胃肠功能的调节上具有重要意义［2］。
我们发现ghrelin能促进小鼠结肠的推进，且有明显的量效关系； 阿托品、 l-name及d-lys3-ghrp-6均能显著抑制ghrelin促进小鼠结肠推进的作用；离体肌条实验中ghrelin可以显著提高近端结肠环形平滑肌条的自发收缩幅度，而在ttx阻断神经效应时ghrelin不能显著提高肌条的自发收缩幅度。ghrelin对ghsr具有较强的亲和力，能通过结肠上的ghsr发挥促进结肠推进的作用，3种阻断剂均能阻断ghrelin促进结肠推进的作用。通过体内、外实验说明ghrelin可能是通过结肠肌间神经丛的硝基能神经和胆碱能神经上ghsr起作用。
控制胃肠运动的肌间神经丛属于消化道的内在神经系统。其神经元分布在纵行肌和环形肌之间，其中有以乙酰胆碱和p物质为递质的兴奋性神经元，也有以血管活性肠肽和no为递质的抑制性神经元，主要支配平滑肌细胞。dass等［3］发现ghsr在大鼠胃和结肠的神经细胞上表达，在平滑肌细胞和上皮细胞无表达。这提示ghrelin可能通过肠神经系统发挥作用。xu等［4］发现将豚鼠的肠神经元分离出来，并证实有胃动素、ghrelin及其受体的存在。fukuda等［5］发现辣椒辣素能阻断ghrelin的促大鼠胃肠运动作用。这提示ghrelin通过肠神经通路及对辣椒辣素敏感的感觉传入神经元调节胃肠运动。
ghrelin也在中枢神经系统影响结肠动力。tebbe等［6］的研究说明ghrelin在下丘脑室旁核通过神经肽y1受体和非选择性的促肾上腺激素释放因子1受体发挥胃肠动力的中枢调节作用。
ghrelin可以通过中枢和外周神经促进结肠动力，是极具潜力的推进结肠动力的药物，给胃肠道动力相关性疾病的治疗开拓了新的研究方向，提供了极具潜力的应用前景。
【参考文献】
［1］李海燕，李得香，严祥，等.孤啡肽对大鼠体内外结肠动力的影响.世界华人消化杂志,2006,14（14）:1377-1381.
［2］locatelli v, bresciani e, bulgarelli i, et al. ghrelin in gastroenteric pathophysiology. j endocrinol invest,2005,28（9）:843-848.
［3］dass nb, munonyara m, bassil ak, et al. growth hormone secretagogue receptors in rat and human gastrointestinal tract and the effects ofghrelin. neuroscience,2003,120（2）:443-453.
［4］xu l, depoortere i, tomasetto c, et al. evidence for the presence of motilin, ghrelin, and the motilin and ghrelin receptor in neurons of the myenteric plexus. regul pept,2005,124（1-3）:119-125.
［5］fukuda h, mizuta y, isomoto h, et al. ghrelin enhances gastric motility through direct stimulation of intrinsic neural pathways and capsaicin-sensitive afferent neurones in rats. scand j gastroenterol,2004,39（12）:1209-1214.
［6］tebbe jj, mronga s, tebbe cg, et al. ghrelin-induced stimulation of colonic propulsion is dependent on hypothalamic neuropeptide y1- and corticotrophin-releasing factor 1 receptor activation. j neuroendocrinol,2005,17（9）:570-576.
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