【摘要】 目的: 应用罗丹明123（rho123）结合流式细胞术（fcm）对人肝癌细胞mhcc97进行分选, 检测甲胎蛋白(afp)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异。方法: 应用罗丹明123（rho123）结合fcm将人肝癌细胞株mhcc97分为rholow和rhohigh组, 采用免疫细胞化学方法观察afp表达和含量。结果: rholow组和rhohigh组比较, afp表达率有显著性差异（p<0.01）。结论: afp在肝癌细胞亚群中表达有差异, rho123结合fcm可以进一步证实肿瘤的异质性。
【关键词】 肝细胞癌 异质性 罗丹明123
恶性肿瘤虽然是从一个发生恶性转化的细胞单克隆增殖而来的, 但在生长过程中, 可能出现其生长速度、 侵袭能力、 对生长信号的反应、 对抗癌药物的敏感性等方面的差异, 而这种异质性的特点正是恶性肿瘤容易复发及产生耐药性的根本原因[1]。瘤细胞异质性及其所导致的肿瘤细胞的生物学行为的改变, 对了解肿瘤细胞的生物学特性和指导临床有重要意义。近年来, 利用流式细胞术（fcm）检测可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞, 利用类似的方法可以将肝癌细胞分成2个不同特性的亚群, 从而获得具有原始干细胞特性的成体细胞。甲胎蛋白(afp)是肝癌特异性最强的标记物, 但是也存在异质性, 临床上常遇到良性肝病的afp值明显增高或是原发性肝癌afp值偏低。在肝癌组织中的差异表达有可能反映了肝癌组织中不同癌细胞在分化程度上的差异。我们应用罗丹明123（rho123）结合fcm对肝癌细胞系mhcc97分选为rholow细胞及rhohigh亚群, 并对各亚群对afp进行差异性比较。
1 材料和方法
1.1 材料 mhcc97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供; dmem培养基、 2.5g/l胰酶为gibco公司产品; 小牛血清为四季青公司产品; rho123为sigma公司产品; 小鼠抗人afp单克隆抗体（mab）、 羊抗小鼠igg二抗免疫组化及dab显色试剂盒为北京中杉公司产品; depc水为sigma公司产品; rnase抑制剂、 随机引物及mmlv逆转录酶为promega公司产品; afp引物为北京三博远志生物技术公司产品; 琼脂糖、 taq dna聚合酶、 facs aria流式细胞分选仪为美国bd公司产品; bx51荧光显微镜及dp70数字图像摄影系统为olympus公司产品; fr980a生物凝胶电泳图象分析系统为复日公司产品。
1.2 方法
1.2.1 不同浓度rho123染色的rholow及rhohigh细胞的分析 mhcc97细胞常规消化, hbss洗涤, 制备成单细胞悬液, 细胞密度为1×105/l。等分细胞悬液, 参考rho123对线粒体膜电位测定的浓度(0.1 mg/l), 分别做0.1 mg/l和0.05 mg/l2个浓度梯度, 对照组加入维拉帕米（终浓度50 mmol/l）, 以未加rho123作为阴性对照, 37℃避光水浴30 min, 冰上5 min终止染色, 冰预冷hbss洗涤细胞并重悬。480 nm激发光源, 检测fitc通道, 对数模式采集信号做一维散点图, 将低rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为rholow细胞的“门”。
1.2.2 rholow及rhohigh细胞的分选 ①细胞染色: mhcc97细胞常规消化, hbss洗涤, 制备成单细胞悬液, 细胞密度为1×106/l。等分细胞悬液, 2组均加入荧光染料rho123根据上一步结果选择合适终浓度, 其中1组再加入维拉帕米, 终浓度50 mmol/l, 37℃避光水浴30 min, 冰上5 min终止染色, 冰预冷hbss洗涤细胞并重悬。②fcm检测分选: 480 nm激发光源检测, 对数模式采集信号做一维散点图, 将低rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为rholow细胞的“门”, 计算百分比, 分选出rholow细胞及rhohigh细胞。
1.2.3 afp免疫细胞化学分析 采用sp方法, 操作步骤参照sp试剂盒说明。afp mab工作浓度1∶100, dab显色, 苏木精复染。以pbs缓冲液代替一抗作为阴性对照。胞质出现棕黄色颗粒定为阳性, 根据阳性细胞百分率分为: 阳性细胞<10%为(-), 阳性细胞10%～25%为(+), 26%～50%为(++), >50%为(+++)。
1.2.4 统计学处理 spss10.0统计软件包分析, 采用非参mannwhitney两独立样本秩和检验。
2.1 rholow及rhohigh细胞的分析 1 mg/l和0.5 mg/l组单纯加入rho123组几乎无低荧光拖尾, 加入维拉帕米无明显改就; 0.1 mg/l组有一低荧光拖尾, 而维拉帕米拮抗组此区有改变; 0.05 mg/l组同样有一低荧光拖尾, 而维拉帕米拮抗组此区有明显改变, 该区比例为2.1%, 分别选取此浓度作为分选浓度(图1)。
图1 rholow及rhohigh细胞分析的fcm分析（略）
a: 阴性对照; b: rho1230.1 mg/l染色; c: rho1230.1 mg/l＋维拉帕米; d: rho1230.05 mg/l; e: rho1230.05 mg/l＋维拉帕米.
2.2 rholow及rhohigh细胞的分选 受检细胞大小、 形态、 细胞质均一性一致, 无pi染色细胞, 无杂细胞干扰。单纯加入rho123组有一低荧光拖尾, 而维拉帕米拮抗组无此区域, 即rholow细胞, 占总数的2.1%(图2), 其余为rhohigh细胞。
图2 rholow及rhohigh细胞分选的fcm分析（略）
2.3 rholow及rhohigh亚群的afp免疫细胞化学比较 2组细胞内均有阳性表达, 阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒, 共计数rholow的肝癌细胞37个, (-)为3个, (+)为5个, (++)为21个, (+++)为9个; rhohigh的肝癌细胞29个, (-)为5个, (+)为16个, (++)为6个, (+++)为2个, 比较有统计学意义（p<0.01）。
3 讨论
原发性肝细胞癌是我国常见恶性肿瘤之一, 死亡率居世界之首（占40%）, 因此, 对肝癌的防治是重点[2]。癌发病机制的研究表明, 肝脏中具有肝祖细胞特征的卵圆细胞参与了肝癌的发生; 肝癌组织的异质性表明, 并不是每个肝癌细胞都具有行成肿瘤的能力, 肝癌细胞之间在耐药性上也有巨大的差异, 这提示肝癌组织中可能存在有具有表型和功能特殊的肝癌细胞[1], 分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、 揭示肝癌复发和转移的机制具有重要的意义, 并为治疗肝癌提供一个新的策略。
造血干/祖细胞具有将荧光染料hoechst33342或rho123泵出细胞外的特性, 利用这一特性并结合fcm可对其进行分离纯化[2]。rho123/fcm的基本原理是利用了干细胞对染料具有排斥性这一特异性功能标志, 干细胞能通过细胞表面的p糖蛋白将进入胞内的rho123主动外泵至胞外, 表现为低荧光的特征, 可分选为rholow和rhohigh 2个亚群[3, 4]。而且多药抵抗的现象一般伴随p糖蛋白的过度表达。lo等[5]用rho123/fcm成功富集了大鼠精原细胞, 认为rho123/fcm相对hoechst/fcm在分离精原细胞上是有优势的。
本实验中将培养的人肝癌细胞根据对rho123染料外排能力不同分选为rholow和rhohigh 2个亚群。2个亚群在afp表达上存在明显差异。afp属胚胎类抗原, 作为1种胚胎时期或病理状态的基因表达产物, 它伴随着胚胎发育和细胞分裂旺盛的过程。afp是胚胎时期肝脏细胞合成的一种蛋白质, 出生后基本不再合成。临床上, afp已经被作为常规诊断肝细胞肝癌的标志物之一。此外, 它还被作为术后或治疗后预测预后的标志物之一。据oyunsuren等[6]研究, 在术后骨髓中afpmrna检测阴性的患者中, 第1年和第3年的存活率分别为96.6%和91.4%; 而阳性的患者, 存活率分别为86.2%和55.5%。
肝癌细胞分化程度越低, 合成的afp越多, afp表达水平从一定程度上可判断肝癌细胞的分化程度[7]。afp表达在2个亚群中有明显差异, 且强阳性主要分布在rholow亚群中, 提示rholow亚群是具有更原始表型的细胞亚群, 我们同时对此mhcc97细胞系用hoechst33342染色后进行分选, sp细胞所占的比例为1.8%[8], 与rho123分选比例类似（2.1%）, 还应结合其他肝干细胞表面标志如ck7、 ck19[9]或是应用原代细胞进行进一步研究。
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