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小鼠肾成纤维细胞(降浊颗粒对慢性肾衰竭大鼠肾组织纤维连接蛋白的影响)

2022-11-07  本文已影响 503人 
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[摘要] 目的 本研究拟通过动物实验,观察降浊颗粒对5/6肾切除慢性肾衰竭(CRF)大鼠肾组织纤维连接蛋白(FN)的影响,来探讨降浊颗粒对CRF的治疗效果及抗肾间质纤维化的机制。 方法 选择健康Wistar雄性大鼠120只,随机分为假手术组及模型组。5/6肾大部切除法建立CRF大鼠模型。模型组大鼠随机分为五组给药。动物灌胃给予生理盐水或给药,连续60 d。观察实验大鼠治疗前后的体征及一般状态,血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的变化,取大鼠肾脏病理切片,采用免疫组织化学染色(SP法)检测FN表达情况。 结果 降浊颗粒能够降低CRF大鼠血清BUN、Scr水平,贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05),高、中、低剂量组与贝那普利组比较,差异无统计学意义(P > 0.05);降浊颗粒能够降低实验大鼠肾组织中的FN的表达,降浊颗粒高剂量组与模型对照组比较差异有高度统计学意义(P < 0.01),降浊颗粒高、中剂量组与贝那普利组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 降浊颗粒能够减少CRF大鼠血清BUN、Scr水平,抑制大鼠肾组织FN的表达,干预肾间质纤维化,最终延缓大鼠CRF进展,以降浊颗粒高、中剂量组效果最好,其疗效与贝那普利相当。
  [关键词] 降浊颗粒;慢性肾衰竭;肾间质纤维化;纤维连接蛋白
  [中图分类号] R692.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(a)-0018-03
  慢性肾功能衰竭(CRF)是各种原发或继发性肾脏病终末期的共同表现,据国际肾脏病协会统计,本症自然人群发病率为98~198/百万人口,我国的统计资料显示尿毒症的年发病率为100~130/百万人口[1],且有逐年增多的趋势。尽管分子生物学、免疫学飞速发展,对CRF的发病机制有了深入的认识,但是对于CRF的治疗,目前除替代疗法和肾脏移植,尚无其他满意的治疗方法。深入开展CRF的防治研究,延缓肾脏病的进展,减少CRF的发生具有重要的现实和经济意义。中医的辨证论治有着多靶点、综合治疗的效果,探讨中医药治疗CRF的有效药方已越来越受到重视。
  “降浊颗粒”(由陈皮、茯苓、党参、半夏、生姜、大黄等组成)针对CRF患者胃肠机能紊乱这个环节而设,以健脾和胃、理气化湿、降浊止呕为主,经过长期临床验证降浊颗粒能明显改善CRF患者的胃肠道症状[2],还发现该药对降低CRF患者血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、血磷,升高血钙也起到了一定的作用。降浊颗粒在改善CRF患者的生存质量、延缓CRF进程、延缓透析时间、使患者带病延年等方面具有重要的现实意义[3-5]。本研究通过观察降浊颗粒对CRF大鼠肾组织纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的影响,观察降浊颗粒对CRF的治疗作用及抗肾间质纤维化的机制。
  1 材料与方法
  1.1 实验仪器
  BM-IX生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司),台式干燥箱202-0型(北京市永光明医疗器械厂),LEICA RM2235切片机,CS-IV摊片烤片机(孝感市宏业医用仪器有限公司)。
  1.2 实验动物
  Wistar雄性大鼠120只,清洁级[动物合格证号:SCXK(川)2010-15],体重(200±20) g,6~8周龄。
  1.3 实验药物
  降浊颗粒(15 g/袋;批号:20100501;云南理想药业有限公司生产),洛丁新(盐酸贝那普利;10 mg/片;国药准字H20030514;批号:008000;北京诺华制药有限公司),FN小鼠单克隆抗体[Abcam;FN(ab6328)],超敏SP(鼠/兔)试剂盒(KIT-9730)(迈新生物技术公司)。
  1.4 实验方法
  1.4.1 动物模型的制作 选择健康Wistar雄性大鼠120只,随机分为假手术组及模型组,5/6肾大部切除法(两期手术)建立CFR大鼠模型。
  Ⅰ期手术:10%水合氯醛0.3 mL/100 g(体重)腹腔麻醉,背左侧12肋下脊柱旁竖切口,充分剥离左肾包膜,迅速切除上、下1/3肾组织,以明胶海绵压迫切面止血,然后分层缝合。术后10 d行Ⅱ期手术,同样的方法麻醉,右侧背部切开暴露右肾,结扎肾蒂,摘除右肾。假手术组与模型组同期行2次手术,但只打开腹腔,剥离肾包膜后缝合腹腔。全部动物自由摄取普通饲料和饮水。
  Ⅱ期术后大鼠喂养7周后,随机抽出假手术组2只、模型组大鼠10只处死,取残余肾作病理HE染色,观察肾小球、肾小管、肾间质变化,见图1;所有大鼠尾部采血,测血BUN、Scr;确定CRF模型造模成功。造模期间大鼠死亡18只。
  1.4.2 动物分组 模型组大鼠随机分为五组:模型对照组、贝那普利组、降浊颗粒高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组,每组各15只;加假手术组(15只)共六组大鼠。
  1.4.3 给药方法 降浊颗粒为临床经验方,60 kg人用剂量为45 g/d。大鼠给药剂量根据人与动物体表面积折算公式:理论上大鼠等效量=45 g×0.018×5=4.05 g,即理论上大鼠给予降浊颗粒有效剂量为4.05 g/(kg·d),降浊颗粒低剂量组为临床等效组,降浊颗粒中剂量组给药剂量为等效剂量的2倍,即8.1 g/(kg·d),降浊颗粒高剂量组给药剂量为等效剂量的4倍,即16.2 g/(kg·d)。
  ①假手术组(正常对照组):予生理盐水2 mL/d灌胃;②模型对照组:予生理盐水2 mL/d灌胃;③贝那普利组:予2 mL/d(1.2 mg/d)贝那普利悬液灌胃;④降浊颗粒低剂量治疗组:予降浊颗粒4.0 g/(kg·d)灌胃;⑤降浊颗粒中剂量治疗组:予降浊颗粒8.1 g/(kg·d)灌胃;⑥降浊颗粒高剂量治疗组:予降浊颗粒16.2 g/(kg·d)灌胃。六组动物连续给药60 d,全部动物自由摄取普通饲料和饮水。

1.4.4 检测内容及方法 ①一般状态:精神状态、摄食、活动、体毛、尿量、体重及生存率;②血清Scr、BUN;③FN免疫组织化学染色(SP法)技术分析:采用免疫组化SP法检测肾小管-间质FN,第一抗体采用FN小鼠单克隆抗体,第二抗体采用超敏SP(鼠/兔)试剂盒,DAB显色。
  1.5 结果判定
  阳性:细胞胞浆或细胞膜出现棕黄色染色。按以下分析:①按平均灰度评分:平均灰度灰度数值从256到0,256到0代表从白到黑。平均灰度数值越小,表示染色越深,表达量越多。②按阳性细胞率评分:按染色阳性细胞占每个视野范围评分:3分:>相应视野50%;2分:占相应视野25%~50%;1分:<相应视野25%;0分:无。每张切片低倍镜下依序单盲观察5个视野,计算各项计分之和。
  1.6 统计学方法
  实验结果采用SPSS 13.0 for Windows统计软件分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间的比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 一般情况
  造模后模型组大鼠与假手术组比较,进食量少,精神差,反应迟钝,活动减少,体重减轻,肢尾湿冷,鼠毛无光泽且有耸毛现象。贝那普利组和降浊颗粒各组经过治疗后,大鼠进食有所恢复,鼠毛较模型组润泽、光亮,活动有所增多,体重有所增加。
  给药期间大鼠死亡情况:假手术组无死亡,贝那普利组死亡1只,模型对照组死亡3只,降浊颗粒低剂量组死亡2只,降浊颗粒中剂量组死亡2只,降浊颗粒高剂量组死亡1只。各组动物死亡率无明显差异。
  2.2 血生化检查
  经治疗后,贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组血清BUN、Scr水平明显低于模型对照组,差异有统计学意义(P < 0.05),降浊颗粒高、中、低剂量组与贝那普利组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。
  2.3 降浊颗粒对5/6肾切除大鼠FN阳性细胞率及平均灰度的影响
  经治疗后,贝那普利组,降浊颗粒高、中、低剂量组FN阳性细胞率低于模型对照组,差异有高度统计学意义(P < 0.01);降浊颗粒高、中剂量组,贝那普利组FN平均灰度较模型对照组增高,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。降浊颗粒高、中剂量组FN表达与贝那普利组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1、图2。
  3 讨论
  肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病慢性进展,最终导致肾功能衰竭的共同机制,而细胞外基质(ECM)的过度积聚是导致肾纤维化的最主要因素之一。研究证实,ECM合成和降解失衡是ECM聚集及肾小球功能损伤的主要原因[6]。ECM主要是由LN、FN、Col Ⅲ等成分组成。
  FN是细胞外基质中一类重要的糖蛋白,主要位于小管间质区,彼此以纤维结构相连,对肾小管正常结构起着重要作用,正常情况下,FN在肾脏表达不明显,在肾间质病变时表达增强,进一步的研究又发现其变化与总的细胞外基质的变化趋势相一致,在炎症条件下,对介导细胞增殖和其他细胞外基质成分的沉积具有重要意义[7]。
  在本研究中,模型对照组与假手术组比较FN表达增加,符合慢性肾衰竭病理改变。经治疗后,贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组FN阳性细胞率低于模型对照组,降浊颗粒高、中剂量组和贝那普利组FN平均灰度较模型对照组增高;降浊颗粒高、中剂量组降低FN表达疗效与贝那普利组相当。说明降浊颗粒能减少CRF大鼠肾组织FN的表达,干预肾间质纤维化,延缓大鼠CRF进展,尤其以高、中剂量组疗效最佳,其疗效与贝那普利相当。
  [参考文献]
  [1] 陈灏珠.实用内科学[M].12版.北京:人民卫生出版社,2005:2078-2094.
  [2] 吉勤,李桢,吴净,等.降浊止呕颗粒对慢性肾衰竭胃肠机能调节的临床观察[J].中国中西医结合肾病杂志,2004,5(5):287.
  [3] 吉勤,杨蕊娇,吴净,等.降浊止呕颗粒对延缓慢性肾衰竭进展的临床研究[J].云南中医学院学报,2007,30(4):38-41.
  [4] 刘培允.益肾降浊方灌肠治疗慢性肾衰竭的临床观察[J].中国医药导报,2008,5(24):101.
  [5] 熊有明,谢正兰.慢性肾衰竭的中医药治疗进展[J].医学综述,2009,15(20):3155-3157.
  [6] 赵慧颖,黄雯,黄海长,等.基质金属蛋白酶在大鼠肾小球硬化中的表达[J].中国血液净化,2008,7(11):610-614.
  . Nephrol,2002,15(6):633-642.

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