【摘要】 目的 构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv²tk)和人类细胞因子白细胞介素²2(il²2)的联合表达质粒载体并观察其在人类肺腺癌细胞系a549细胞中的表达。方法 设计、合成多克隆位点（mcs）插入到质粒psnav中,然后分别从其他不同的质粒剪切片段hsv²tk、内部核糖体进入位点(ires)、il²2并依次接入到mcs中，最终得到目的质粒psnav²tk²ires²il2(pmtⅱ)。目的质粒经酶切、dna测序鉴定正确后，转染到a549细胞中。用rt²pcr方法、elisa法检测转染后细胞目的基因的转录和表达；进一步倒置显微镜观察、mtt法检测更昔洛(gcv)对转然后细胞的杀伤作用。结果 经酶切、dna测序、rt²pcr法和elisa法鉴定，双基因真核表达载体pmtⅱ序列正确并能有效表达。进一步倒置显微镜观察和mtt法检测表明hsv²tk/gcv自杀基因系统对a549细胞有明显的杀伤作用。结论 成功构建了pmtⅱ真核表达载体，并观察了其对a549细胞的杀伤效应，为进一步研究hsv²tk/gcv联合il²2基因治疗肺癌提供实验基础。
【关键词】 肺癌 基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶 (hsv²tk) il²2
0 引言
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，在我国城市人口中，它的病死率居各类恶性肿瘤之首。如何进一步提高治疗效果，降低死亡率一直是人们研究的重要课题。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因系统(hsv²tk/gcv)以其具有的自杀效应在很多肿瘤的治疗研究中都显示了有效的作用，尤以其独特的“旁观者效应”受到广大研究者的青睐，在针对肺癌方面也有一定的治疗作用[1] 。但是肺癌的发生、发展是一个多步骤、多基因参与的过程，而且不同组织类型肺癌细胞其自身生物学特性也存在很大差异，因而国内外有学者提出单一的基因治疗对肺癌细胞的杀伤作用有限[2²3]，宜采用联合治疗来提高有效性。近些年肿瘤的th1/th2免疫反应状态也是国内外研究的热点之一，有文献报道在肺癌患者体内存在thl/th2细胞因子的平衡失调,发生了th1向th2的异常漂移, 存在il²2等th1细胞因子分泌的不足[4²6]。而且临床上单独应用il²2治疗肺癌及恶性胸水也显示了一定的治疗作用[7]。基于以上的理论和实验基础，联合hsv²tk和il²2的双基因治疗有可能提高单基因治疗的效果。在本实验中，我们构建了含有hsv²tk与il²2双治疗基因的真核表达载体，并初步观察了它在体外对非小细胞肺癌株a549的杀伤效应，为进一步基因治疗研究奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
腺相关病毒载体psnav购自北京本元正阳生物有限公司；psc11tk、pcdnail²2为美国梅尔医学院石长信博士惠赠；pires²eyfp为加拿大多伦多大学温晓燕博士惠赠；肺腺癌细胞系a549细胞，大肠杆菌dh5α为本室保存；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、dna连接酶试剂盒、去磷酸化酶试剂盒均为takara公司（日本）产品；trizol试剂、lipofectamine2000为invitrogen公司（美国）产品；各种限制性内切酶为fermentas公司（美国）产品、taqdna聚合购自赛百胜公司（上海）；逆转录酶、rna酶抑制剂为promega公司产品（美国）；gcv为湖南五洲通制药有限公司产品；elisa试剂盒购自上海西塘(进口分装)，胎牛血清为杭州四季青公司产品。mcs序列、引物序列以及基因测序由上海生工、上海博亚生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 psnav²tk²ires²il2载体的构建 psnav本身cmv启动子后的限制性内切酶位点较少，根据插入片段所需内切酶设计、合成mcs，插入载体中。从其他质粒中剪切需要的片段hsv²tk、ires（其前接有一段增强表达的ivs序列）、il²2并按不同的酶切位点依次插入mcs多克隆位点中，得到最终目的质粒psnav²tk²ires²il2(pmtⅱ)，酶切鉴定正确后送公司测序。在此构建过程中同时可获得只含有hsv²tk片段的对照质粒psnav²tk(pmt)。 目的质粒构建流程如图1所示：
图1 psnav²tk²ires²il2( pmtⅱ)的构建流程（略）
fig 1 construction of psnav²tk²ires²il2( pmtⅱ)
1.2.2 细胞培养及基因瞬时转染 细胞生长于含10％胎牛血清的dmem的培养基中，在37℃、5％co2饱和湿度的温箱中培养。细胞分为三组，每组三孔：（1）a549/pmtⅱ组，转染质粒pmtⅱ；（2）a549/pmt组，转染质粒pmt；（3）a549组,未转染质粒。每个实验重复三次。转染前一天以105细胞接种于24孔板。待细胞生长达到90%融合时，按脂质体lipofectamine2000操作说明书转染质粒。转染时细胞换无血清培养基，dna（μg）与脂质体（μl）按预实验所得最佳比例1∶1混合后转染。6h后，换完全培养基（含10%胎牛血清）继续培养，48h后，进行后续检测试验。
1.2.3 rt²pcr法检测hsv²tk基因与il²2基因mrna的转录 以trizol试剂提取细胞总rna、再逆转录得到cdna，再经过pcr扩增出目的片段。引物序列见表1。pcr反应条件：94℃预变性5min，94℃解链30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次，72℃总延伸10min，4℃终止反应。取5μl 的pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。用柯达凝胶分析软件分析电泳条带的光密度。
表1 pcr引物序列及扩增片段大小（略）
tab 1 primer sequence of target genes
1.2.4 elisa法检测il²2的分泌 收集上述细胞的培养上清，每孔细胞上清设三个复孔，按照elisa试剂盒的说明书进行检测。
1.2.5 gcv作用后细胞生长状况的测定 将a549细胞按5×103/孔接种于96孔板,分组同上，次日将pmtⅱ和pmt分别转染细胞，转染步骤同上，转染36h后，gcv浓度按照0、1、10、50和100mg/l依次加入细胞中,每个浓度设3个复孔。每天更换加药培养基，并观察细胞的形态学变化。作用120h后，加入5g/l mtt 10μl，37℃作用4h，去上清，加入dmso 150μl，置摇箱中轻摇混匀后于490nm测吸光值。细胞存活率按下式计算：细胞存活率（％）=a实验组/a对照组×100%(以gcv浓度0mg/l为对照组)。
1.3 统计学方法
所有数据均以±s表示，用spss 13.0统计软件包处理，多组间均数比较采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 pmtⅱ 的酶切、测序鉴定
重组质粒酶切片段大小与理论值相一致，测序结果提示与pubmed上所提供的基因序列相同。
2.2 rt²pcr检测hsv²tk基因与il²2基因mrna的转录
结果如图2所示，a549/pmtⅱ组、a549/pmt组, 均可检测到hsv²tk基因的 pcr产物，而a549组无此条带。三组均可检测到il²2的pcr产物。以gapdh为内参，采用半定量rt²pcr方法测定il²2的转录水平变化，结果显示a549/pmtⅱ组转染质粒pmtⅱ 48h后与其他两组相比il²2 mrna水平均升高（p<0.05），其他两组相比差异无统计学意义（p>0.05）。
1: 100bp dna marker; 2: a549组(198bpgapdh and 127bpil²2);3: a549/pmt组(302 bptk,198bpgapdh and 127bpil²2);4: a549/pmtⅱ组(302 bptk,198bpgapdh and 127bpil²2)
图2 hsv²tk与il²2 rt²pcr终产物电泳分析（略）
fig 2 electrophoretic analysis of the hsv²tk and il²2 rt²pcr final products
2.3 elisa法检测各组细胞上清中il²2的分泌
a549/pmtⅱ组il²2分泌量显著高于a549/pmt组和a549组(p<0.05)，后两组相比差异无统计学意义(p>0.05)，见图3。
图3 三组细胞培养上清中il²2水平 （略）
fig 3 the level of secreted il²2 among the three groups
2.4 倒置显微镜下观察自杀基因对细胞的杀伤的形态学变化
倒置显微镜下观察，a549/pmtⅱ组细胞密度随gcv浓度的增高和作用时间增长而逐步减小，gcv 10mg/l以上作用120h的各复孔均见细胞呈不规则形，多角形，甚至变圆，胞膜皱缩，部分细胞脱落悬浮，大量细胞碎片产生，部分细胞核染色质凝集，有调亡小体产生，gcv 100mg/l组作用120h镜下几乎不见梭形存活细胞。a549/pmt组经不同浓度gcv作用后也表现出相同的效应。而gcv作用于a549组则无此效应，见图4。
a：a549；b：a549/pmtⅱ gcv 0 mg/l；c：a549/pmtⅱ gcv 1mg/l；d：a549/pmtⅱ gcv 10mg/l；e：a549/pmtⅱ gcv 50mg/l；f：a549/pmtⅱ gcv 100mg/l
图4 gcv作用120h后对a549/pmtⅱ细胞的杀伤效应 (×100) （略）
fig 4 cytotoxicity of gcv on a549/pmtⅱ for 120h(×100)
2.5 mtt测定细胞的存活率
随着gcv剂量加大，a549/pmtⅱ、a549/pmt存活率呈逐渐下降趋势，具有一定的剂量依赖效应。作为对照的野生型a549剂量达到10mg/l仍然没有明显的影响，此剂量时hsv²tk阳性细胞的抑制率已经达到了66％(a549/pmt)、68％(a549/pmtⅱ)。在野生型a549细胞中，浓度为100mg/l时才表现出对细胞的抑制效应，见图5。
图5 gcv作用120h后三组细胞的存活率（略）
fig 5 the survival rate of cells treated by gcv for 120 h
3 讨论
hsv²tk/gcv自杀基因系统目前已经用于多种肿瘤的治疗研究。但单独应用hsv²tk/gcv系统尚存在不足，如仅针对分裂期细胞，杀伤效应有限，缺乏靶向性，肿瘤内部用药对远处转移肿瘤无效等。il²2通过激活机体的免疫系统不仅能杀伤肿瘤细胞提高治疗效果，而且还通过增强免疫细胞对肿瘤抗原的提呈能力对远处转移肿瘤细胞达到杀灭作用，同时可以以负反馈的方式杀灭携带有目的基因的肿瘤细胞而调节基因的表达水平，从而限制自杀基因对周围正常细胞的杀伤作用以及过度炎症反应的发生等。hsv²tk和il²2在杀瘤作用方面存在一定的互补性，因而成为基因联合治疗的新研究热点之一。国内外各学者已经对某些类型的肿瘤进行了其联合治疗的研究，如甲状腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等[8²10]。barzon等 [8]构建含hsv²tk和il²2两种基因的重组逆转录病毒载体,用于甲状腺癌细胞株及裸鼠移植瘤模型。结果显示：对于分化甲癌联用双基因与单用il²2相比瘤体可减小80％，而对间变性甲状腺肿瘤，瘤体可达到完全消除；而且他们在此基础上对两例晚期甲癌患者进行了临床治疗研究[9]，在试验中可观察到患者外周血th1细胞因子表达的增加以及肿瘤实体中坏死灶的形成。但国内外尚未有两者联合共表达治疗肺癌的报道，因而本试验针对肺癌展开研究。
实验中，我们首先构建了pmtⅱ质粒。该真核表达质粒携带有hsv²tk基因和人il²2cdna，它们通过ires联接，因而可以在一个转录单位内共转录，从而实现双基因干预的目的。通过经酶切、dna测序鉴定证实pmtⅱ质粒序列正确。将质粒转染细胞，进一步通过rt²pcr对细胞内hsv²tk与il²2 的mrna进行检测，证实了pmtⅱ真核表达载体构建成功。
为了验证载体的功能，我们进行了进一步的实验。本研究中，目的质粒转染a549细胞后，可以看到在细胞的生长抑制试验中，gcv对转染有hsv²tk基因的两组a549细胞均有明显的生长抑制作用，而且呈一定的浓度依赖效应，而未转染基因的细胞，只有gcv浓度达到100mg/l时才表现出对细胞生长的抑制。hsv²tk/gcv自杀基因系统旁观者效应的发挥需要细胞间的连接。在光镜观察中可以看到gcv浓度在50mg/l、100mg/l作用120h时，细胞数大量减少，细胞间连接也随之大面积减少，与此相对应，我们在mtt试验中，观察到在gcv浓度大于10mg/l时，此系统对细胞的生长抑制趋势明显减缓，可见旁观者效应可能是hsv²tk/gcv系统发挥自杀作用的主要途径。在光镜观察过程中，不同浓度的gcv作用72h时，各组细胞间并没有出现肉眼可见的明显差异，这可能与hsv²tk/gcv系统对细胞的生长抑制作用需要较长的时间才能显现有关[10]。
本实验用elisa法对质粒转染后的细胞上清中il²2的水平进行了检测，结果发现3组细胞均能检测出有il²2的表达，但转染pmtⅱ质粒组显著高于另两组，提示pmtⅱ质粒能表达il²2，说明双表达载体构建是成功的。对il²2蛋白抗瘤效应的观察须在在体实验中进行，本实验尚未开展。
综上所述，本实验成功构建并验证了pmtⅱ双表达质粒，并初步观察了hsv²tk/gcv系统在体外对肺癌细胞株的杀伤作用，为进一步在动物机体内研究hsv²tk/gcv联合il²2基因治疗肺癌，以及应用腺相关病毒载体进行肺癌的基因治疗奠定了实验基础。
【参考文献】
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