慢性中性粒细胞白血病分子诊断探讨

　　慢性中性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＮＬ）是一种极为少见的ＢＣＲ－ＡＢＬ阴性骨髓增殖性肿瘤（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｎｅｏｐｌａｓｍｓ，ＭＰＮ），其特征是持续地外周血成熟中性粒细胞明显增多、骨髓粒系增生和肝脾肿大，无髓系细胞发育异常形态改变和ＢＣＲ－ＡＢＬ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧ－ＦＲＢ、ＦＧＦＲ１重排。以往由于缺乏特定的分子标志，本病的明确诊断很大程度上取决于仔细地鉴别反应性粒细胞增多和表现相近的其他髓系肿瘤，基本属于排除性诊断。随着２０１３年发现大多数患者具有集落刺激因子３受体基因（ＣＳＦ３Ｒ）突变［１］，并经严格定义的ＣＮＬ中验证，确认其为ＣＮＬ发病分子基础，２０１６年ＷＨＯ淋巴与造血组织肿瘤分类中纳入ＣＳＦ３Ｒ突变作为ＣＮＬ诊断主要指标［２］，使得ＣＮＬ不再是排除性的诊断，而成为一种形态学和分子遗传学定义的髓系肿瘤。现就ＣＮＬ分子诊断研究进展介绍如下。

　　１ＣＳＦＲ

　　ＣＳＦ３Ｒ基因定位于染色体１ｐ３４．３，含有１７个外显子，编码８１３个氨基酸的集落刺激因子跨膜受体，为粒细胞提供增殖和生存信号，并有助于其分化和功能。ＣＳＦ３Ｒ是一单链细胞表面受体，属于细胞因子受体Ⅰ型超家族，其胞质部分包括有不同的功能区，即近膜区域有丝分裂信号传导，行使增殖功能；远端区域羧基末端与成熟信号传导有关，行使分化和增殖调节功能［３］。ＣＳＦ３Ｒ与其配体Ｇ－ＣＳＦ结合后，通过经典的下游途径，包括ＪＡＫ－ＳＴＡＴ，ＳＲＣ家族激酶（尤其是ＬＹＮ），非受体酪氨酸激酶ＳＹＫ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰ激酶和ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路发挥作用，诱导中性粒细胞分化、增殖、存活，并刺激中性粒细胞功能。研究证明ＣＳＦ３和ＣＳＦ３Ｒ在粒细胞生成过程起着非常重要作用，小鼠缺乏ＣＳＦ和ＣＳＦ３Ｒ基因缺陷可表现严重的粒细胞缺乏。在严重先天性粒细胞缺乏患者，除了明确的遗传性致病基因（如ＥＬＡＮＥ或ＨＡＸ１）突变外，有报道４０％可伴有获得性造血干细胞ＣＳＦ３Ｒ胞质远端羧基末端过早截断的基因无义突变，通过与其它癌基因共同作用延长细胞生存，增加克隆优势，被认为与高急性白血病转化相关［４－５］。另外，ＣＳＦ３Ｒ基因胚系突变尚可导致显性遗传的先天性中性粒细胞增多或家族性慢性中性粒细胞白血病［６－７］，偶尔在急性髓系白血病也报道检出这种类似突变。

　　２ＣＳＦ３Ｒ突变与ＣＮＬ诊断

　　为了查找潜在的分子发病原因，２０１３年Ｍａｘ－ｓｏｎ等［１］采用原代细胞深度测序结合酪氨酸激酶特异的小干扰ＲＮＡ或小分子激酶抑制剂作用的方法，对传统临床诊断的ＣＮＬ和不典型慢性髓系白血病（ａＣＭＬ）进行研究，２７例患者中１６例（５９％）检出ＣＳＦ３Ｒ突变，其中９例ＣＮＬ患者中８例（８９％）检出ＣＳＦ３Ｒ突变，均涉及位于外显子１４的胞外近膜结构域点突变，７例（７８％）为ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ突变，１例为ＣＳＦ３ＲＴ６１５Ａ突变。这些近膜结构域点突变单独发生更为多见，少部分与另一类导致ＣＳＦ３Ｒ胞质尾部过早截断的移码突变或无义突变共同存在，形成复合突变。胞外近膜结构域点突变和胞质尾部过早截断突变两种类型突变分别通过下游ＪＡＫ－ＳＴＡＴ通路和ＳＲＣ酪氨酸激酶通路介导，均具有体外转化能力，并相应地对激酶抑制剂芦可替尼和达沙替尼呈现不同敏感性。以ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ表达的造血细胞进行移植，小鼠发生致死性的ＭＰＮ，表现为突出的成熟粒细胞增多、骨髓明显活跃和肝脾成熟粒细胞浸润［８］。Ｐａｒｄａｎａｎｉ等［９］在按照严格ＷＨＯ标准诊断的１２例ＣＮＬ患者中更是１００％检出ＣＳＦ３Ｒ基因突变，１０例为ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ突变；而ａＣＭＬ、浆细胞病相关ＣＮＬ、原发性骨髓纤维化症（ＰＭＦ）和慢性粒－单细胞白血病（ＣＭＭＬ）患者无一例检出该突变。这些均表明ＣＳＦ３Ｒ突变在ＣＮＬ非常常见，是ＣＮＬ一致性的生物学特征；ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ是ＣＮＬ敏感而特异的分子标志，应纳入ＣＮＬ诊断标准。２０１６年修订的ＷＨＯＣＮＬ诊断标准将ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ和其他激活突变纳入诊断［２］，即：①外周血白细胞计数≥２５×１０９／Ｌ，分叶核＋带状核中性粒细胞≥８０％，前体中性粒细胞（早幼、中幼和晚幼粒细胞）＜１０％，原粒细胞少见，单核细胞＜１×１０９／Ｌ，无粒系形态发育异常；②骨髓增生活跃，中性粒细胞比例及数量增多，中性粒细胞形态正常，原粒细胞占有核细胞比例＜５％；③不符合ＷＨＯ定义的ＢＣＲ－ＡＢＬ１阳性慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）、真性红细胞增多症（ＰＶ）、原发性血小板增多症（ＥＴ），或原发性骨髓纤维化（ＰＭＦ）；④无ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ或ＦＧＦＲ１基因重排，无ＰＣＭ１－ＪＡＫ２融合基因；⑤ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ或其他活化ＣＳＦ３Ｒ基因突变，或持续性（≥３个月）的中性粒细胞增多、脾肿大，且没有可识别原因的反应性中性粒细胞增多，包括无浆细胞肿瘤，或者如果存在浆细胞病，须有髓系细胞细胞遗传学或分子学研究证实的克隆性证据。

　　３继发性或反应性粒细胞增多的排除更为方便

　　临床上中性粒细胞增多可见于多种良恶性疾病，精确诊断ＣＮＬ需要仔细与这些具有类似表现的疾病进行鉴别。ＣＭＬ、ａＣＭＬ、ＣＭＭＬ以及ＭＰＮ／ＭＤＳ等各自均具有特征性分子和细胞形态学特征，诊断也在２０１６年ＷＨＯ髓系肿瘤分类中明确界定，与ＣＮＬ鉴别并不困难。类白血病反应与ＣＮＬ均可表现有外周血白细胞增多、骨髓增生明显活跃、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合基因阴性和正常染色体核型，二者的鉴别极具挑战性。尽管仔细地病史询问、临床检查和外周血分析大多可以提供相应诊断线索，但若能证明存在克隆性造血，包括识别出ＣＳＦ３Ｒ突变或其它分子或细胞遗传学异常，则更加支持ＣＮＬ的诊断。而缺乏ＣＳＦ３Ｒ基因突变虽并不能完全排除ＣＮＬ诊断的可能性，但此时要诊断ＣＮＬ更需格外谨慎。ＣＮＬ经常同时伴发浆细胞病，以多发性骨髓瘤最为常见，意义未定单克隆γ球蛋白血症次之，文献报道可高达３２％［１０］。鉴于肿瘤性浆细胞可合成Ｇ－ＣＳＦ，ＣＮＬ能自发缓解，基础浆细胞病治疗中性粒细胞计数改善，患者预期寿命更长，尤其均不能检出特征性的ＣＳＦ３Ｒ基因突变，表明伴发浆细胞病的“ＣＮＬ”与单纯ＣＮＬ是两种病因和机制不同的病理异常，支持前者实为浆细胞病继发的中性粒细胞增多［１１－１２］。另外，某些实体瘤也可易位生成Ｇ－ＣＳＦ，导致副瘤性白细胞增多［１３－１４］，表现与ＣＮＬ相似，需注意鉴别。

　　４ＣＳＦ３Ｒ突变类型与ＣＮＬ临床表现及预后

　　ＣＮＬ有两种不同的ＣＳＦ３Ｒ突变类型，一是常见的近膜端突变，主要包括Ｔ６１８Ｉ和Ｔ６１５Ａ点突变。膜近端突变阻止ＣＳＦ３Ｒ的Ｏ－糖基化，导致活性二聚体构型增加，配体非依赖的受体激活，以及经由ＪＡＫ２的构成性下游信号传导［１５］。已经证明最常见的ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ突变经由ＪＡＫ－ＳＴＡＴ途径发挥作用，对ＪＡＫ抑制剂芦可替尼治疗敏感。另一种是移码突变或无义突变，导致ＣＳＦ３Ｒ的胞质尾端过早截断（Ｄ７７１ｆｓ、Ｓ７８３ｆｓ、Ｙ７５２Ｘ和Ｗ７９１Ｚ）［１，５］。受体的截断致使负调控基序丧失，包括与受体内化有关的双亮氨酸分选基序，以及靶向并进而降解受体的细胞因子信号传导３（ＳＯＣＳ３）的抑制剂结合位点［１６－１７］，破坏受体转运，延迟受体内化和（或）降解，导致细胞表面ＣＳＦ３Ｒ表达增加，ＳＴＡＴ５持续活化，细胞增殖加强［１８］。单独的ＣＳＦ３Ｒ的胞质尾端截断突变可能不足以驱动白血病发生，在ＣＮＬ也极为罕见，对ＳＲＣ激酶抑制剂达沙替尼治疗敏感［１９］。绝大多数ＣＮＬ呈ＣＳＦ３Ｒ基因近膜端突变，最高约３０％的患者同时表达近膜端突变和胞质尾端截断突变的复合突变。ＣＳＦ３Ｒ基因复合突变可诱导小鼠发生侵袭性致死性白血病，并在体外显示对ＪＡＫ和ＳＲＣ抑制剂均耐药，而对ＭＡＰＫ信号传导途径抑制剂ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ更为敏感［２０］。最近，Ｓｚｕｂｅｒ等［２１］将１９例ＣＳＦ３Ｒ基因突变ＣＮＬ患者按照突变类型分组为１４例Ｔ６１８Ｉ突变和５例其它ＣＳＦ３Ｒ基因突变（包括Ｍ６９６Ｔ突变２例，Ｔ６４０Ｎ突变，ｃ．２２１５Ｃ＞Ｔ截断突变和Ｉ５９８ＩＳＹＮ突变各１例），比较２组患者的临床特征。结果显示，ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ突变患者具有更多的不良临床和实验室特征，倾向于诊断时年龄更大，白细胞计数更高、血红蛋白和血小板计数值更低，以及异常核型发生率更高。这些不良特征最终转化为较其它ＣＳＦ３Ｒ突变类型患者显著降低的整体生存（ＯＳ）。

　　５ＣＮＬ其它突变基因

　　除了ＣＳＦ３Ｒ基因突变外，在ＣＮＬ患者中尚可检测到不同发生频率的其它基因突变，包括ＡＳＸＬ１（４７％～７７％），ＳＥＴＢＰ１（０～７５％），ＳＲＳＦ２（４４％），ＴＥＴ２（２０．５％～５０％），ＣＡＬＲ（５％～１２．５％），以及ＪＡＫ２（８％）等［２２－２６］。另外，１０％左右的ＣＮＬ患者缺乏ＣＳＦ３ＲＴ６１８Ｉ及其它近膜端基因突变，提示应该尚有另外的基因异常参与其白血病发生。与潜能未定的克隆性造血（ＣＨＩＰ）一致的多种基因突变的检出，促使考虑在ＣＨＩＰ背景下晚发ＣＳＦ３Ｒ突变并最终导致ＣＮＬ表型的可能性。而Ｚｈａｎｇ等［２７］二代基因测序研究结果显示，超过半数的ＣＮＬ、ａＣＭＬ、ＣＭＭＬ、ＭＰＮ－Ｕ或ＭＤＳ／ＭＰＮ－Ｕ患者表现出３种不同的途径共同发生突变，涉及染色质修饰、表观遗传调节、剪切复合物和信号传导基因。ＣＮＬ这种多通路基因突变共同发生的模式与ａＣＭＬ、ＭＤＳ／ＭＰＮ－Ｕ和ＣＭＭＬ非常相似，作者提出该病归类为ＭＤＳ／ＭＰＮ较ＭＰＮ更为合适。ＣＮＬ是一少见的ＭＰＮ，临床表现异质性非常高，在缺乏疾病特异性标志时代其精确诊断具有极大挑战性。２０１３年ＣＳＦ３Ｒ突变与ＣＮＬ发病因果关系的阐明导致ＣＳＦ３Ｒ突变纳入修订的ＷＨＯＣＮＬ诊断标准，并随之发现其它相关基因。这些ＣＮＬ致病基因突变的识别不仅丰富了分子诊断方法，也为基于此的靶向药物研发奠定了基础。

　　作者：张凤奎 宋琳