[摘要] 目的 探讨唐古特大黄多糖组分1（RTP1）对电离辐射所致肠上皮细胞损伤的保护作用。 方法 采用大鼠空肠上皮细胞（IEC-6细胞株），共分为5组，正常对照组（normal control，NC）、辐射对照组（irradiation control，IC）以及RTP1低剂量组（10 μg/mL）、中剂量组（30 μg/mL）和高剂量组（100 μg/mL），以6.0 Gy 60Coγ射线一次性照射损伤细胞，损伤前用RTP1预处理细胞48 h。采用MTT比色法测定细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡情况并对细胞周期进行检测。 结果 与IC组比较，RTP1可显著提高IEC-6细胞的增殖能力，减少受照射细胞的凋亡和坏死，降低G1期细胞数量，增加S期细胞数量。 结论 RTP1对辐射损伤的肠上皮细胞具有一定的保护作用。 [关键词] 辐射损伤；IEC-6细胞；唐古特大黄多糖；细胞增殖；细胞周期 [中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（b）-0022-03 ＼放射性肠损伤是盆腹腔肿瘤放射治疗时最棘手的并发症之一，且越来越多的证据表明，肠黏膜损伤可进一步加重原发疾病，甚至诱发多脏器功能不全、全身炎症反应综合征，形成恶性循环，甚至危及生命[1]。目前治疗多以对症治疗为主。因此，寻找具有肠黏膜放射损伤预防和治疗作用的物质十分重要。 本实验室采用微滤结合不同截留相对分子量的管式超滤膜串联工艺的方法，从唐古特大黄中分离、提取了5个不同分子量段的大黄多糖（rheum Tanguticum polysaccharide，RTP），且前期的研究表明，分子量段在6×105～8×105的组分1（RTP1）能够促进肠上皮细胞的增殖、移行和分化[2]，并能够对抗过氧化氢诱导的肠上皮细胞凋亡和坏死[3]，在体内对溃疡性结肠炎小鼠表现良好的治疗作用，同时具有免疫调节功能[4-5]，提示RTP1在肠黏膜损伤修复方面具有一定的作用。本实验拟观察其对电离辐射损伤所致肠上皮细胞的保护作用，为寻找新的、对辐射所致肠黏膜损伤具有防护作用的药物提供依据。 1 材料与方法 1.1 细胞、试剂与仪器 第三军医大学西南医院烧伤研究所陈健博士提供了本实验所用的正常大鼠小肠隐窝上皮细胞（IEC-6）；唐古特大黄多糖组分1（RTP1）由第四军医大学药理学教研室刘莉博士采用微滤结合不同截留相对分子量的管式超滤膜串联工艺的方法分离得到；培养细胞所用RPMI 1640培养基和超滤胎牛血清分别购自美国Gibco公司和天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；检测细胞增殖的4-甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司，使用前将其用磷酸缓冲液（PBS）配制成5 mg/mL浓度的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤以除去溶液中的细菌，置4℃冰箱避光保存备用。流式细胞仪检测细胞凋亡用的Annexin V-FITC和碘化丙啶（propidium iodine，PI）凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物技术有限公司产品。 CO2孵箱为美国Nuaice公司产品，倒置荧光显微镜为德国Leica公司产品，酶联免疫检测仪为华东电子管厂产品，流式细胞仪（Coulter XL型）为美国Beckman公司。 1.2 IEC-6细胞的培养 IEC-6细胞培养于RPMI 1640培养液中（含10%超滤胎牛血清、100 mg/L链霉素及1×105 U/L青霉素），置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，2～3 d换液1次，当细胞长至铺满培养瓶底80%时，加入0.25%胰酶溶液消化细胞，进行传代，取对数生长期细胞用于实验。 1.3 RTP1对IEC-6细胞增殖的影响 将细胞分为5组（每组6个复孔），分别为：①正常对照组（normal control，NC），②辐射对照组（irradiation control，IC），③RTP1 10 μg/mL组，④RTP1 30 μg/mL组，⑤RTP1 100 μg/mL组。收集对数生长期细胞，调整细胞密度为1×106/L，以200 μL/孔体积将细胞接种于96孔培养板，培养24 h使细胞贴壁，按照上述分组方式，NC组和IC组各加入100 μL/孔的PBS，给药组亦按照100 μL/孔体积加入不同浓度的RTP1，培养48 h后，除NC组外，各组均以6.0 Gy 60Coγ射线照射，照射距离3 cm，空气比释动能率为3.767 Gy/min。照射后继续培养24 h，采用MTT比色法测定细胞活力。测定时每孔加入20 μL MTT溶液（浓度为5 mg/mL），继续培养4 h，终止培养，吸取孔内培养液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔的测定吸光度（A）值，按照下式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（A实验-A对照）/A对照×100%。 1.4 流式细胞术观察细胞凋亡 细胞分组及处理同“1.3”项下方法。照射结束后24 h，按照如下步骤进行：①配制孵育缓冲液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH 7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2；②配制标记液：Annexin V-FITC和PI加入到孵育缓冲液中，终浓度为1 mg/L；③收集细胞：0.25%胰酶消化细胞，调整每样本细胞数至5×1010个/L，1 000 r/min离心5 min，弃培养液；④洗涤细胞：以孵育缓冲液洗涤细胞1次，1 000 r/min 离心5 min；⑤标记液重悬细胞：10 μL的标记液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min；⑥沉淀细胞：1 000 r/min离心5 min，孵育缓冲液洗洗涤细胞1次；⑦染色：加入SA-FLOUS荧光溶液，避光，4℃下孵育20 min，同时振荡；⑧流式细胞仪分析：激发光波长488 nm，检测波长：515 nm检测FITC荧光，大于560 nm检测PI。1.5 流式细胞仪检测细胞周期 细胞分组及处理同“1.3”项下方法。照射后24 h终止培养，PBS缓冲液冲洗3次，0.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，去上清，收集细胞重悬于预冷的PBS缓冲液中（内含5%胎牛血清），缓慢加入-20℃预冷的浓度为95%的乙醇，并使终浓度为75%，4℃过夜。上机前PBS离心洗涤2次，调整细胞浓度为5×1010 cells/mL，取适量细胞悬液加入200 μL RNase A酶（浓度1 mg/mL），37℃孵育30 min，加入100 μg/mL的PI染液使终浓度为20 μg/mL，避光冰浴20 min显色，行流式细胞仪检测。 1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，统计方法使用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 RTP1对IEC-6细胞增殖的影响 6.0 Gy 60Coγ射线照射可显著降低细胞存活率（存活率下降了58%），照射前预先给予RTP1可剂量依赖性地抑制射线所致的细胞死亡，细胞存活率明显上升，小、中、大剂量组的RTP1细胞存活率分别为56%、65%和83%。见图1。 2.2 RTP1对辐射细胞凋亡的影响 正常活细胞Annexin V、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V、PI均高染。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。从流式细胞检测结果可以看到：NC组细胞几乎全部集中在左下象限，表明基本全部为活细胞，与NC组相比，IC组右下象限和右上象限细胞明显增多，凋亡百分率为31.3%，与IC组相比，RTP1组右下象限细胞及右上象限细胞明显减少，凋亡百分率为21.5%，表明照射前给予RTP1可明显抑制细胞凋亡的发生。流式细胞术检测结果见图2。 2.3 RTP1对辐射损伤后IEC-6细胞周期的影响 与NC组比较，IC组G1期细胞数明显增加，S、G2/M期细胞数减少，表现为G1期阻滞，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与IC组比较，RTP1中、高剂量处理组G1期细胞显著减少，S期细胞增加，表现为处于DNA合成期的细胞明显增加，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见表1。 3 讨论 肠上皮是对放射敏感性很高的再生组织，肠上皮细胞的损伤常常表现为细胞增殖受到抑制，细胞周期进程发生改变，细胞发生凋亡和坏死[6]。Wroblewski等[6]利用X射线照射IEC-6细胞后发现，即使在较小剂量的辐射条件下，IEC-6细胞DNA合成也会受到抑制，并导致细胞生长障碍。细胞周期作为机体生长发育、组织再生和细胞增殖分化的控制中心，对其进行检测是分析细胞增殖动力学的一种快速而准确的方法，辐射引起的细胞周期改变常常表现为G1期阻滞，G2期和S期延迟[7]。 本实验发现，IEC-6细胞受到照射后，细胞增殖受到明显抑制，RTP1预处理可以显著提高细胞的增殖能力，凋亡实验结果亦表明，6.0 Gy 60Coγ射线可显著诱导IEC-6细胞凋亡和坏死，RTP1预处理可明显减少受照射细胞的凋亡和坏死，表明RTP1可通过抑制受照射细胞凋亡而发挥细胞保护作用；细胞周期检测结果表明，60Coγ射线照射后，IC组细胞G1期细胞明显增加，S、G2/M期细胞数减少，表现为G1期阻滞，RTP1预处理可使G1期细胞数显著减少，S期细胞增加，说明处于DNA合成期的细胞数明显增加，以上结果表明，RTP1对辐射损伤的肠上皮细胞具有一定的保护作用，但RTP1通过何种机制发挥该保护作用尚需进一步研究。 [参考文献] [1] Meineke V， Fliedner TM. Radiation induced multi-organ involvment and failure：challenges for irradiation accident medical management and future research [J]. BJR，2005，27（Suppl）：196-200. [2] 刘琳娜，刘莉，王志鹏，等.唐古特大黄多糖促进肠上皮细胞的增殖、移行和分化[J].中国药理学通报，2005，21（4）：486-489. [3] 刘琳娜，张峰，梅其炳，等.唐古特大黄多糖对过氧化氢诱导的肠上皮细胞凋亡的保护作用及其可能机制[J].中国药理学通报，2010，26（7）：877-881. [4] 刘莉，梅其炳，周四元，等.大黄多糖对TNBS诱导的大鼠结肠炎的治疗作用[J].中国中药杂志，2003，28（3）：246-249. [5] Liu L，Guo ZJ，LU ZG，et al. The beneficial effect of Rheum tangguticum polysaccharide on protecting against diarrhea，colonic inflammation and ulceration in rats with TNBS-induced colitis： the role of macrophage mannose receptor in inflammation and immune response [J]. International Immunopharmacology，2008，8（4）：1481-1492. [6] Wroblewsik R，Jalnas M，Van DG，et al. Effects of irradiation on intestinal cells in vitro and in vivo [J]. Histol Histopathol，2002，17（1）：165-177. [7] Taiji T，Xing C，Nagako S，et al. Ginsenoside Rd prevents and rescues rat intestinal epithelial cells from irradiation-induced apoptosis [J]. Food and Chemical Toxicology，2008，46：3080-3089.
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