摘 要：目的 探讨HMGB1蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及对原发性肝细胞癌的诊断价值。方法 应用免疫组化及计算机图像分析方法测定30例原发性肝细胞癌及癌旁组织标本（自身配对组织）HMGB1蛋白表达，及其与原发性肝细胞癌临床病理因素的关系。结果 HMGB1在肝癌组织呈过表达，其表达高于肝癌旁组织（P＜0.05）；HMGB1在包膜不完整、有淋巴结转移肝癌中的表达分别高于包膜完整及无淋巴结转移者（均P＜0.05），随着Edmondson病理学分级增加，HMGB1表达增高（P＜0.05）。而HMGB1表达与肿瘤患者年龄、性别、肿瘤大小无明显相关（均P＞0.05）。结论 HMGB1可能在原发性肝细胞癌的发生、发展，浸润及转移中发挥重要的作用。HMGB1可能是原发性肝细胞癌的一种新的潜在的肿瘤特异性标志物。
关键词：肝细胞癌；HMGB1 ；免疫组织化学 ；计算机图像分析
高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box-B1,HMGB1）是高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白，哺乳动物中HMGB1具有99%的同源性质，HMGB1作为一种核蛋白，在DNA结构、基因转录、重组、细胞存活等方面发挥重要的调控作用[1,2]。最新研究发现HMGB1与原发性肝细胞癌有关，由于其在原发性肝细胞癌中的表达特异性升高而引起研究者[3-5]的注意。因此，我们采用免疫组织化学及计算机图像分析技术方法分析HMGB1蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及与其临床病理因素的关系，为进一步探讨HMGB1与原发性肝细胞癌的发生、发展，浸润、转移的关系，寻找新的生物学标记物及治疗靶点奠定基础。材料与方法一、一般资料材料：标本来自2008年1月-2011年3月昆明市第一人民医院肝胆外科的原发性肝癌患者，以距癌灶边缘5cm为分界分别留取肝癌癌灶组织，非癌组织各30例。其中男24 例，女6 例，年龄36-75 岁，平均年龄59.6±10.5 岁。瘤体＜5 cm 16例，瘤体≥5 cm 14例，所有标本均经病理组织学证实为原发性肝细胞肝癌。二、方法1.免疫组织化学法 兔抗人HMGB1多克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒分别购自美国PTG公司，北京中杉金桥生物技术有限公司。肝癌及癌旁组织免疫组化以经典的S-P法进行（HMGB1工作浓度1：100，每片滴加HMGB1一抗，4℃冰箱过夜）DAB显色，以PBS液代替一抗作为阴性对照，以已证实HMGB1染色阳性的肝癌标本作阳性对照。 2.计算机图像分析 应用HPIAS—1000 高清晰度病理图文分析系统对免疫组化结果进行定量分析。（详细操作步骤参照HPIAS—1000型图像分析仪使用手册。）3. 结果判断： （1）免疫组化 细胞核和/或细胞浆出现棕黄色或棕褐色染色颗粒为阳性细胞。每张切片在高倍镜下（X200）随机观察5个视野，计数200个细胞/视野，阳性细胞数＜15%为表达阴性（-），阳性细胞数15%-50%为表达弱阳性（+），阳性细胞数51%-75%为表达中等强度阳性（++），阳性细胞数＞75%为表达强阳性（+++），其中阳性细胞数大于50%为过表达。（2）计算机图像分析 每组标本均在400×放大倍数下按照无偏采样原则取5个视野，每个视野均按照无偏采样原则取5个细胞进行测定。根据阳性单位（PU）结果来判断免疫组化染色强度的差异。PU值用均值+标准差（）表示。4 统计学分析应用SPSS13.0统计软件分析处理。多样本和两样本半定量积分的阳性表达比较均采用Kruskal-Wallis秩和检验，蛋白表达强度差异PU值（）进行单因素方差分析后行LSD-t检验。（检验水准ɑ=0.05，P＜0.05具有统计学意义。）三 结果1.免疫组化染色 癌旁组织中HMGB1蛋白表达较低，表现为少数胞核和（或）胞浆微弱着色。HMGB1蛋白在肝癌组织中呈过表达，阳性颗粒主要位于细胞核中，细胞浆也有微弱着色（图1～4）。肝细胞癌组织中HMGB1阳性表达率为80%，与癌旁组织30%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。肝细胞癌组织Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ、Ⅳ级中HMGB1蛋白阳性表达率逐渐增加，分别为62.5%、83%、90%，（均P＜0.05）。随着肝细胞癌淋巴结的转移，HMGB1蛋白的阳性表达率增加，分别为76.2%、89%，包膜不完整肿瘤的HMGB1阳性率（81.8%）高于包膜完整者（78.9%），其差异均有统计学意义（P＜0.05）。而HMGB1蛋白与肝细胞癌患者年龄、性别及肿瘤大小无关（均P＞0.05）。计算机图像分析结果与免疫组化结果一致（详见表1～2）。
中呈阳性表达 ×100 中呈阳性表达 ×4002． 计算机图像分析结果 表1 HMGB1与肝细胞癌及癌旁组织的关系
表2 HMGB1与原发性肝细胞性肝癌临床病理因素的关系组别 例数 阳性单位（PU） （） P值性别 男 25 13.67 ± 0.35 0.517 女 5 11.11 ± 1.08 年龄/岁 ＜50 6 9.83 ± 0.96 0.180 ≥50 24 14.30 ±0.10肿瘤大小/cm ＜5 16 12.17 ± 0.43 0.432 ≥5 14 14.47 ± 1.23肿瘤包膜 完整 19 11.13 ± 0.59 0.041 不完整 11 16.89 ± 8.80 Edmondson分级Ⅰ级（高分化） 8 6.57 ± 0.45 0.041Ⅱ-Ⅲ级（中分化） 12 12.51 ± 0.18 0.001 Ⅳ级（低分化） 10 18.95 ± 1.12 0.034 淋巴结转移 无 21 10.99 ± 0.01 0.014 有 9 18.48 ± 1.23
四 讨论 高迁移率蛋白B1（high-mobility group box-B1,HMGB1）基因于1973年首先由Sanders等[6,7] 在小牛胸腺中发现，人HMGB1定位于13q12带，编码含215个氨基酸的单链多肽，HMGB1由3个功能区组成：两个含正电荷区域（A盒和B盒）和一个呈负电荷的羧基端。HMGB1作为一种重要的晚期炎性介质,与脓毒症、神经轴突生长、免疫性疾病、恶性肿瘤、缺血再灌注损伤等疾病相关。而HMGB1在肿瘤中的作用为现今研究的热点，作为一种潜在的多功能“晚期”炎性介质，HMGB1被坏死肿瘤细胞释放道微环境中，而细胞外的HMGB1可导致慢性炎症/修复性反应，可导致肿瘤细胞的存活、进展及转移[8]。 迄今为止，研究发现[9,10]多种肿瘤组织和患者血清中均有HMGB1的高表达（如结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、宫颈癌），且其配体RAGE在不同的肿瘤细胞中也有表达。给予HMGB1或RAGE抑制剂，可以明显抑制肿瘤细胞增殖[13]。HMGB1并与肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤大小及预后明显相关[3,9]。而HMGB1在肿瘤发生发展中的作用机制目前有以下两种说法[12,13]：①HMGB1的过表达可致肿瘤表型基因的表达异常，而引起肿瘤；②HMGB1 的过表达可使获得肿瘤表型的细胞免于凋亡，继续生长，导致肿瘤。原发部位肿瘤细胞分泌HMGB1到达区域淋巴结，通过减少巨噬细胞数量削弱淋巴组织的抗转移潜能。HMGB1通过与其配体RAGE 结合, 激活了细胞内JNK 、NF-κB p65、和p42/ p44 、Rac1/Cdc42等，进而激活MAPK s, PI3K/Akt, Rho GTP酶,Jak/STAT, and Src family kinases（沉降红细胞家族激酶）等[14-16]信号传导通路,引起明胶酶A ( MM P-2) 和明胶酶B( MMP-9) 的激活,引起纤维蛋白溶酶等系统激活, 使细胞外基质降解, 抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞浸润、转移。 迄今为止，关于HMGB1与肝癌相关研究的报道少见。Sakuraoka Y[4,17]等检测结果显示肝癌细胞株HepG2中有RAGE mRNA及其蛋白的表达，说明HMGB1能刺激人肝癌细胞株HepG2的生长、增殖。Cheng等[3,18]研究发现, 肝细胞癌患者HMGB1的血清水平比慢性肝炎及肝硬化患者明显升高, 血清HMGB1的表达与肝癌的TNM分期、病理学分级及淋巴结转移密切相关，由此可见血清HMGB1与肝细胞癌的发生、发展有关。而HMGB1在原发性肝细胞癌组织中的发生、发展有着怎样的作用，及HMGBI与肝细胞癌临床病理特征的具体关系正是我们研究的目的。 本研究使用免疫组化及计算机图像分析结果显示，HMGB1蛋白在肝癌组织中呈过表达，其检测结果与冯华国[16]的研究一致，提示HMGB1在原发性肝细胞癌的发病过程中起着关键性的作用。随着肝细胞癌Edmondson病理学分级增加，HMGB1蛋白阳性表达增加，有淋巴结转移肝癌患者比无转移者HMGB1表达增加，肿瘤包膜不完整比包膜完整者HMGB1表达增加。笔者认为HMGB1在不同病理阶段其在机体含量不同，对肿瘤细胞的促增殖作用不同。而HMGB1蛋白表达与肝细胞癌患者年龄、性别及肿瘤大小无相关。 本研究首次揭示了HMGB1蛋白表达与人肝细胞癌组织Edmondson病理学分级、包膜完整、淋巴结转移密切相关。提示HMGB1在原发性肝细胞癌的发生、发展、浸润和转移中可能发挥了重要作用。HMGB1可能是原发性肝细胞癌的一种新的潜在的肿瘤特异性标志物。为肝细胞癌分子靶向治疗提供了依据。参考文献：[1]Stros M. HMGB proteins interactions with DNA and chromatin. Biochim Biophys Acta.2010,1799:101-113.[2]Increased expression of HMGB1 is associated with poor prognosis in human bladder GL, Zhang LH, Bo JJ, et al.J Surg Oncol. 2012 Jan 11. doi: 10.1002/jso.23040. [Epub ahead of print]。[3]Cheng BQ, Jia C Q, Liu CT, et al. Serum high mobility group box chromosomal protein 1 is associated with clinicopathologic features in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Dig Liver Dis.2008, 40: 446 -452.[4] Sakuraoka Y, Sawada T,et al. MK615 decreases RAGE expression and inhibits TAGE-induced proliferation in hepatocellular carcinoma cells[J].World J Gastroenterol. 2010，16(42):5334-5341.[5]高保华，汪雯，牛春燕等. HMGB1在肝癌及癌旁组织中的表达及意义[J]. 肝胆胰肿瘤.2011，27（8）：850-853.[6]Haque A, Kunimoto F, Narahara H, et al. High mobility group box 1 levels in on and off-pump cardiac surgery patients[ J ]. Int Heart J. 2011,52(3):170-174.[7] Kew RR, Penzo M, Habiel DM, et al. The IKKα-Dependent NF-κB p52/RelB Noncanonical Pathway Is Essential To Sustain a CXCL12 Autocrine Loop in Cells Migrating in Response to HMGB1[ J ]. J Immunol. 2012 Jan 27. [Epub ahead of print][8] Dong Xda E, Ito N, Lotze M T, et al. High mobility group box I( HMGB1) release from tumor cells after treatm ent: implications for development of targeted chemoimm unotherapy [ J]. J Immunother, 2007,30( 6)?:596-606.[9] Ellerman JE, Brown CK, de Vera M, Zeh HJ, Billiar T, et al. Masquerader: high mobility group box-1 and cancer[J].Clin Cancer Res. 2007.13:2836-2848.[10] Kostova N, Zlateva S,Ugrinova I, Pasheva E. The expression of HMGB1 protein and its receptor RAGE in human malignant tumors[J].Mol Cell Biochem. 2010,337 (1-2):251-258.[11] Taguchi A，BloodDC，del ToroG，et al．Blockade of RAGE-ampho- terinsignalling suppresses tumour growth and metastasis［J］．Nature，2000，405（6784）：354-360．[12]Muller S,Ronfnai L, Blan chi M E. Regulated expression and subcellular localization of H M GB1, a chromatin protein w ith acytokine function[J]. J Intern M ed, 2004, 255: 332 -343.[13]Hiwatashi，k，at a1．A novel function of the receptor for advanced glycation end-products(RAGE) in association with tumorigenesis and tumor differentiation of HCC[J]．AnnSurg Oncol，2008，15(3)：923-933．[14] Palumbo R, De Marchis F, Pusterla T, et al. Src family kinases are necessary for cell migration induced by extracellular HMGB1[J]. J Leukoc. Biol. 2009,86:617-623.[15]Toure F, Zahm JM, Garnotel R, et al. Receptor for advanced glycation end-products (RAGE) modulates neutrophil adhesion and migration on glycoxidated extracellular matrix[J]. Biochem. J. 2008,416:255-261.[16]Reddy MA, Li SL, Sahar S, et al. Key role of src kinase in S-100B-induced activation of the receptor for advanced glycation end products in vascular smooth muscle cells[J]. J Biol Chem. 2006,281:13685-13693.[17]贺新春，范学工等. HMGB1对人肝癌细胞株HepG2体外增殖的影响. 中南大学学报（医学版）. 2010，35（5）：451-457.[18]冯华国. HMGB1在原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义. 重庆医科大学硕士学位论文.2011.5
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