论文导读:：株肿瘤细胞总RNA的提取结果。基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。论文关键词：肿瘤细胞，RASSF1基因家族，转录，RAS家族 近年来较多研究都发现染色体3P21.3等位缺失在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌等常见肿瘤中频繁发生，推测该位点可能存在一个或多个肿瘤抑制基因。2000年，Dammnn等 [1]利用酵母双杂交筛选的方法从3P21.3内120 kb长最小纯合缺失区分离出一种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因，由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)与小鼠RAS相关区域家族1（RAS association domainfamily 1）与小鼠RAS效应蛋白Nore1高度同源，遂命名为RAS相关区域家族1，即RASSF1基因。由于选择性剪切和不同启动子的使用，RASSF1基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。有研究发现RASSF1能直接参与细胞周期的调控医学论文，在体内和体外能抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡[2]。 最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因段的丢失，DNA核苷酸序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与抑癌基因DNA核苷酸序列中的胞嘧啶核苷酸（C）和鸟嘌呤核苷酸（G）二联连结中（CpG）的胞嘧啶碱基环中的第5位碳原子上所发生的甲基化具有极其重要的相关性[4]。抑癌基因R ASSF1的表达作用机制已经初步明确,但其转录本基因在恶性肿瘤中的作用研究较少，尤其是RASSF1B,RASSFIF在肿瘤细胞中的表达比较还未见相关报道。本文旨在通过RT-PCR的方法，检测五种常见的肿瘤细胞中RASSF1家族中RASSF1B,RASSF1F不同转录本的表达情况，为基因治疗提供理论基础。 1 试验材料与方法 1.1 试验材料 5株肿瘤细胞AGS（胃腺癌）、95D（高转移肺癌）、LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)和U937（白血病细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MMLV反转录试剂盒购于Promega公司。 1.2细胞培养 试验所选用的五种肿瘤细胞用DMEM(Invitrogen)加10 %小牛血清，CO2培养箱中37 ℃恒温培养至细胞均匀覆盖细胞瓶约3/4。 1.3cDNA的制备 以Trizol提取的方法提取细胞总RNA并纯化, 用MMLV反转录得到五种肿瘤细胞的cDNA。 1.4 RT-PCR 利用DNAstar软件设计RASSF1家族两种转录本的特异引物，以人β－actin为内参，通过RT-PCR方法检测这两种转录本在五种肿瘤细胞中的表达情况论文的格式。引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s 医学论文，72 ℃ 1.5 min 30个循环，72 ℃ 10 min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。 1.5 应用生物信息学软件分析7种转录本的剪切方式。 2 结果 2.1 两种转录本的读码框结构的比较 表1 扩增RASSF1的两种转录本的引物设计
基因
异构体
GenBank
登录号
引物 Forward （F）/
Reverse （R）
读码框长度（bp）
扩增片段长度（bp）
B
NM_170712
F：atgagcttgaacaaggacgg
570
591
R：tccacctgggggtacaagagg
F
NM_170716
F：atgtcgggggagcctgagct
279
281
R：ggtcaggtgtctcccactccac
actin
AK225414
F：gagaccttcaacaccccagcc
1656
512
R：gGCgtacaggtctttgcggatg
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