作者：侯巍，高金波，张云杰，孙丽娜，滕杨
【摘要】 目的探讨不同浓度的氮酮、丙三醇、油酸对大黄中蒽醌类有效成分透皮吸收的影响。 方法以离体小鼠皮为透皮屏障，采用改进franz扩散池装置，采用高效液相色谱法同时测定接收池中蒽醌类物质大黄素，大黄酚，大黄素甲醚，大黄酸的含量，计算累积透过量。结果氮酮、丙三醇和油酸对大黄中蒽醌类物质均有促透作用，其促透作用强弱顺序为：2%氮酮>1%氮酮>4%氮酮>6%氮酮；6%丙三醇>4%丙三醇>2%丙三醇>1%丙三醇；2%油酸>4%油酸>6%油酸>1%油酸。 结论 氮酮、丙三醇和油酸对大黄中蒽醌类物质大黄素、大黄酚、大黄甲醚、大黄酸的促透作用具有一定的量效关系。
【关键词】 透皮吸收；促进剂；大黄；蒽醌类；有效成分
abstract：objectiveto evaluate the effect of azone, propanetriol and oleic acid under different concentrations on transdermal absorption of effective components in anthraquinones from rhubard.cn透皮吸收制剂是一种新型药物剂型，具有可维持稳定的血药浓度、避免胃肠道酶解作用和肝脏的首过效应、降低药物的毒副作用、给药方便等优点，为目前最受青睐的四大类新型制剂之一［1］。皮肤表皮的角质层对大多数外用药物形成一道难以渗透的生理屏障，许多药物透过该屏障的速度都很慢［2］。克服皮肤的屏障作用，寻找促进药物透皮吸收的方法，使药物在一定时间内经皮渗透并达到治疗所需的血药浓度，成为透皮给药领域开发和研究的热点之一［3］，应用透皮吸收促进剂是增加药物透皮吸收的首选方法［4］。我们对大黄提取物中蒽醌类物质大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄甲醚等在常用的促透剂氮酮，丙三醇和油酸三种溶剂体系条件下的透皮吸收进行了实验研究，旨为大黄的合理设计和开发提供依据，并为大黄透皮制剂的合理设计和开发提供参考。现报道如下。
1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（美国安捷伦1100，包括真空在线脱气机，四元泵，自动进样器，紫外检测器等），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），分析天平（上海恒平科学仪器有限公司），df-101s恒温水浴磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司），franz扩散池（沈阳玻璃仪器加工厂）。
西域大黄（安国市京兴药业责任有限公司），大黄酚，大黄素，大黄素甲醚，大黄酸，芦荟大黄对照品（中国生物药物制品研究所），丙三醇（锦西化学试剂厂），油酸（国安恒业精细化工有限公司），氮酮（北京市德鸿盛生物化学科技有限公司），无水乙醇等均为分析纯试剂。
2 方法与结果
2.1 大黄中蒽醌类物质的提取与制备
大黄粉碎后，过筛，取50 g大黄粉末，用300 ml 95%乙醇，水浴恒温回流4次，0.5 h/次，回流时温度控制在79℃左右，合并回流液。用旋转蒸发仪对合并液进行浓缩至70 ml左右，回收乙醇，浓缩液再进行乙醚（100 ml）萃取3次，合并，温度控制在35℃左右，用旋转蒸发仪蒸去乙醚（回收）。液体变粘稠后，继续加热至50℃蒸干，得黄棕色固体，即蒽醌粗品。对粗品用碱溶酸沉法进行纯化，再离心，得黄棕色沉淀，阴凉、干燥处风干，得黄棕色晶体粉末（大黄总蒽醌），备用。
2.2 分析方法的建立与考察
2.2.1 色谱条件
据参考文献［15］设定标准曲线的测定条件如下：色谱柱为c18柱；流动相为甲醇-0.1%磷酸-水=425∶1∶75；检测波长438 nm；流速1.0 ml/min。大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚的分离情况见图1。
2.2.2 标准曲线
精密称取大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚对照品5.2，6.3，2.0，4.5 mg，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升分别含0.52，0.63，0.20，0.45 mg的对照液，再吸取各对照品液1 ml，用甲醇定容于10 ml量瓶中。0.45 μm的滤膜过滤后，分别进样1，5，10，15，20，25 μl。以对照品进样量为纵坐标（y），峰面积分值为横坐标（x）绘制工作曲线，大黄酸：y=0.0371x+0.012 9（r=0.999 9）；大黄素：y= 0.009 1x-0.013 3（r=0.999 9）；大黄酚：y=0.008 1x+0.032 （r=0.999 9）；大黄素甲醚：y=0.013 2x+0.024 5（r=0.999 9）。
2.2.3 精密度实验
精密吸取大黄蒽醌混合液20 μl，在“2.2.1”项的色谱条件下，连续进样5次。rsd%分别为大黄酸0.13，大黄素0.11，大黄酚0.11，大黄素甲醚0.08。
2.2.4 稳定性实验
精密吸取大黄蒽醌对照混合液20 μl，分别在0，1，2，6，12 h进样，按色谱条件测定，测定结果大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的rsd分别为0.50%， 0.69%， 0.60%，0.57%。说明大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚非常稳定。
2.2.5 重复性实验
取约12 mg大黄蒽醌5份，用甲醇适当稀释后，用0.45 μm的滤膜过滤，进样20 μl，测定大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，结果rsd%分别为0.62，0.55，0.64，0.45。
2.2.6 回收率实验
精密吸取大黄蒽醌10 μl与对照品混合液4，6，8，10，12，16 μl混合，并用甲醇补充至20 μl后进样测定，计算得大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均回收率分别为100.6，100.7，100.2，100.0。
2.3 体外透皮吸收实验
2.3.1 离体鼠皮的制备
取质量为50～100 g 的小鼠，断颈处死，剃去腹部的毛，剪下皮肤，去除皮下组织，用生理盐水反复多次冲洗，置于-40℃的冰箱中保存。
2.3.2 大黄蒽醌的体外透皮吸收实验
体外渗透扩散装置恒温槽中加入适量水，设定恒温槽中水温为（37±0.1）℃。向垂直扩散池的接收池内加入16.5ml接收液（30%的乙醇，ph=6.0），进行预热，设定接收池搅拌速度为400 r/s。将鼠皮用铁夹子固定在两室之间，向供给池内加入已配好的供试液10 ml（取大黄总蒽醌480 mg，用甲醇定容至100 ml）。分别于0.5，1，2，4，6 h从接收池取样1 ml，同时向接收池中补充等量的接收液。用0.45 μm滤膜过滤，进样20 μl测定。按下式计算累积透过量（μg·cm-1）。 q=cn×5+n-1i=1ci×4a 其中，cn为第n个取样点的药物浓度（μg/ml），ci为第i个取样点的药物浓度，a为扩散面积。以累积透过量q对时间t进行作图，取曲线前端的直线部分进行线性回归，所得方程的斜率即为透皮速率。结果大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的透皮速率分别为：0.142，0.109，0.047 4，0.040 6。6 h时累积透过量（μg/cm2）分别为： 0.918，0.704，0.410，0.304。
2.4 促透剂的促透作用的研究
2.4.1 促透剂的制备
丙三醇，氮酮，油酸分别用50%的乙醇配制成浓度为1%，2%，4%，6%的溶液10 ml作为促透剂。
2.4.2 促透剂作用下的体外透皮吸收在改良franz扩散池恒温槽中加入适量水（37±0.1）℃，在接收池中加入16.5 ml 30%的乙醇（ph=6.0），将鼠皮用铁夹子固定在两室之间，向供给池内加入已配好的不同浓度的促透剂2.0 ml和供试液8.0 ml。于0.5，1，2，4，6 h分别取样1 ml，同时向接收池中补充等量的接收液。用0.45微孔滤膜过滤，进样20 μl测定峰面积，并计算按照下式计算大黄素，大黄酚，大黄素甲醚的累积透过量q，不同浓度的氮酮、丙三醇、油酸对大黄蒽醌增强作用的结果见图3～5。
结果显示出促进剂对它们的吸收均有一定的促透作用，总的趋势为，氮酮：2%>1%>4% >6%，丙三醇：6%>4%>2%>1%，油酸：2%>4%>6% >1%。
3 讨论 多数文献报道，hplc法测定蒽醌类常选用的检测波长在254 nm，但我们根据大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄甲醚的紫外光谱实际扫描结果，确定为438 nm为测定波长，在此波长下它们均有较强的吸收，而且干扰小，灵敏度较高，可满足透皮吸收对各组分的检测。 传统外用法中中药多以醋调外敷现代科学研究证实，醋中的醋酸、乳酸、氨基酸、甘油等化合物，对皮肤有柔和的刺激作用，使小血管扩张，增加皮肤的血液循环。另外本实验结果显示，在ph=6.0的30%乙醇溶液中有利于蒽醌类药物成分的穿透性，这可能与皮肤的生理特性有关。
关于大黄透皮吸收的研究中，现有的报道均对大黄中的大黄酚进行检测，而忽略了大黄中的其他有效成分。所以，本实验检测指标较多，同时对其大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚等进行了透皮吸收的考察，以求得全面科学地探究透皮吸收及其促透作用情况。
本实验通过对大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的体外渗透实验和促透剂对药物渗透的作用研究，得出以下结论：大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的透皮吸收均有一定的促透作用，其中以大黄酸的透皮速率最好。在考察浓度为1%，2%，4%，6%的氮酮、丙三醇、油酸3种促透剂的促渗性能中，以浓度为2%氮酮时具有最大的透皮速率；丙三醇的促渗性能是随着浓度的增加一直呈现增强的趋势；油酸浓度为2%时与氮酮一样也有最大的透皮速率。
【参考文献】 ［1］徐铮奎.四大类新型给药技术未来唱主角［j］.中国药业，2001，10(7):29. ［2］毕殿洲.药剂学，第4版［m］.北京:人民卫生出版社，2001:429. ［3］周运琴.透皮给药系统新方法及新技术的研究进展［j］.天津药学，2001，13(2):5. ［4］方晓阳，叶 青.中药透皮吸收促进剂的研究与发展［j］.中草药，2003，34(2):188.
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