作者：曹志然，王蓓，申文增，戎瑞雪，潘颖，张秋燕，唐志远, 冯天铸
【摘要】 目的研究加味失笑散对心肌缺血再灌注损伤保护的作用机理。方法将日本大耳白家兔40只随机分为5组：假手术组、模型组、加味失笑散低剂量组、加味失笑散中剂量组和加味失笑散高剂量组。采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备缺血和再灌注模型，通过检测缺血前、缺血30min和再灌注60min时血清中超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）和血清肌酸激酶（ck）的变化，探讨加味失笑散对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制。结果缺血30min和再灌注60min 时模型组实验动物的sod活力较假手术组明显降低而mda和ck明显增高（p<0.cn近年来用此方加味治疗各种疾病均收到良好的效果［1］。各地报告应用多种加味失笑散治疗冠心病心绞痛均取得一定疗效，但有关加味失笑散对心肌缺血再灌注损伤作用机制的研究还未见报道。本文观察了加味失笑散对家兔心肌缺血再灌注模型血清中超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）和血清肌酸激酶（ck）等指标的影响，初步探讨了其对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制，为该方用于临床冠心病、心绞痛的治疗提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 动物日本大耳白家兔40只，体重（2.5±0.2）kg，购自于河北省实验动物中心。
1.2 药物加味失笑散由蒲黄6 g，五灵脂6 g，川芎6 g，红花6 g，桃仁9 g，赤芍9 g，郁金9 g，冰片0.05 g组成。药材购自保定市中药材公司，经专家鉴定均为真品。将上述药物按比例组成10剂，水煎煮提取3次，提取液合并，4层纱布过滤，滤液浓缩至适量。冰片用适量乙醇溶解，与浓缩液混合，调整浓度为100%，即1ml相当于1g生药。
1.3 试剂与仪器sod，ck，mda试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，bradford蛋白质定量试剂盒购自tiangen biotech(beijing )，紫外分光光度计，tu1901(上海棱普仪器仪表有限公司)；电热恒温水浴箱，ssw-420-2s（上海博迅实业有限公司）；组织匀浆器，pro200（美国）。
2 方法
2.1 实验动物分组与处理实验动物随机分为5组，假手术组和模型组用等同容积的自来水灌胃；加味失笑散低、中、高剂量组分别用1.19，2.38和3.57 g/kg的药物灌胃，1次/d，共7 d，末次灌胃后12 h，造模并检测指标。
2.2 心肌缺血再灌注损伤模型的制备实验动物用1%的戊巴比妥钠（3.5 ml/kg）耳缘静脉注射麻醉，仰位固定，常规记录肢体ⅱ导联，分离右侧颈动脉并插管用于取血。沿胸骨左缘剪断2～3肋软骨，用乳突牵开器撑开切口，并保持胸膜完整。剪开心包，用止血钳提起左心耳，用小弯针在冠状动脉左前降支根部穿一0号丝线，放置1 cm长、直径为1 mm的硅胶管并结扎，根据心电图检测s-t段的抬高，作为心肌缺血模型建立的标准。假手术组只穿线不结扎，余操作同造模组。观察30 min后，剪断结扎线，开始心肌再灌注，观察60 min。
2.3 血清中sod，ck，mda的检测在缺血前、缺血30 min和再灌注60 min分别从颈总动脉取血1.5 ml，分离血清，按试剂盒说明检测血清中的sod、ck活性和mda含量。
2.4 统计学处理应用spss统计学软件进行统计学数据分析，结果以±s表示，主要统计学方法采用方差分析后进行两两比较（lsd法）。
3 结果
3.1 加味失笑散对实验动物血清中sod活力的影响
结果见表1。表1 加味失笑散对实验动物血清中sod活力的影响（略）
结果表明，缺血前各组实验动物血清sod活力没有显著性差异（p>0.05）,缺血30 min时，模型组和各用药组动物血清中的sod活力均较假手术组降低（p<0.01），但各用药组实验动物血清sod活力明显高于模型组（p<0.01）；再灌注60 min时各组实验动物血清sod活力与再灌注前比较均明显下降（p<0.05），说明缺血再灌注进一步降低了sod活力，而各用药组实验动物血清sod活力明显高于模型组，且有剂量依赖性，表明加味失笑散能改善心肌缺血导致的sod活力的降低。
3.2 加味失笑散对实验动物血清中mda的影响
结果见表2。表2 加味失笑散对实验动物血清中mda的影响（略）
结果表明,缺血前各实验组动物血清mda没有显著性差异（p>0.05），缺血30 min和再灌注60 min时模型组的mda均显著高于假手术组，而各用药组血清mda值均显著下降（p<0.01）。
3.3 加味失笑散对实验动物血清中ck活力的影响
结果见表3。表2 加味失笑散对实验动物血清中ck活力的影响（略） 结果表明，缺血前各组实验动物血清ck活力无显著性差异（p>0.05），缺血30 min和再灌注60 min时模型组的ck活力均显著高于假手术组，而各用药组动物血清ck活力值均显著下降（p<0.01）。
4 讨论
冠心病属于中医学的“胸痹”，临床大多数属于气虚血瘀型。失笑散是历代活血化瘀的代表方剂，由蒲黄和五灵脂组成。本实验所用的加味失笑散由蒲黄，五灵脂，川芎，红花，桃仁，赤芍，郁金，冰片组成，在临床上治疗冠心病心绞痛疗效明显。现代药理研究表明方中的蒲黄具有提高机体免疫力、抗缺氧、抗心肌缺血、抗炎止痛、降低全血粘稠度、减少血小板的聚集等作用；五灵脂可扩张血管，降低血管阻力，增加冠脉血流量，并能缓解平滑肌痉挛［2］；桃仁、红花、赤芍、川芎具有活血祛淤、抑制血小板和红细胞的聚集、稳定红细胞膜、降低血黏度的的作用；同时红花、赤芍也具有清除氧自由基的作用［3～5］，此为本方治疗心绞痛提供了药理依据。
心肌缺血再灌注损伤的机制目前认为与心肌的能量代谢障碍、氧自由基的大量产生、细胞内钙离子的超载、血管内皮细胞分泌的一系列内皮因子等因素有关。氧自由基的大量产生使心肌组织的脂质体(lpo)增多,心肌组织mda的含量增加,从而引起心肌细胞膜结构的改变,心肌细胞受到损伤，导致大量ck的释放，因此，mda和ck是反映心肌氧自由基损伤的直接指标，sod是清除氧自由基的重要酶类，可减轻氧自由基对心肌细胞的损伤作用。本研究结果显示,心肌缺血30 min后模型组实验动物血清sod活性较对照组明显降低，mda和ck明显增高，再灌注60 min后sod活性较缺血期降低更显著，mda和ck进一步增高，说明缺血再灌注加剧了心肌的损伤，与以前报道结果一致［6］。加味失笑散各剂量组sod活性均显著高于模型组，且有剂量依赖性,用药组的mda和ck水平明显低于模型组，结果表明，加味失笑散可通过提高sod的活性，降低氧自由基的产生，抑制了脂质体的氧化，从而对心肌缺血再灌注损伤起到了保护作用。
【参考文献】 ［1］祝光礼，周凡，陈铁龙.黄芪失笑散抗心肌缺血的实验研究［j］.中华中药学刊，2007，25（11）:2232. ［2］章伟明，张卫，曾佳. 中药免疫生脉瓜萎失笑散治疗冠脉内支架植入后再发心绞痛的临床研究［j］.湖南中医药大学学报，2007, 27(4): 49. ［3］王忠键.心痛失笑散治疗冠心病心绞痛疗效观察［j］.中医药临床杂志，2006,18(3)：265. ［4］阮金兰，赵钟祥，曾庆忠，等.赤芍化学成分和药理作用的研究进展［j］.中国药理学通报，2003,19(9)：65. ［5］吴素焕，李立平,徐月清，等. 血府逐瘀汤对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护机制［j］.中国临床康复，2006,10(3)：63. ［6］胡明品，许峰，温怀凯，等.地氟醚预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的影响［j］.浙江医学，2007，29（1）：28.
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