非小细胞肺癌神经内分泌肿瘤，非小细胞肺癌抗原生理性增高

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【摘要】 目的 观察磷酸化蛋白激酶b(pakt)、血管内皮生长因子(vegf)在非小细胞肺癌(nsclc)中的表达，并通过研究癌组织中pakt与血管生成的关系，初步探讨pakt在肺癌发生发展及转移中的机制，为肺癌的早期诊断提供可供参考的新方法。方法 用免疫组化sp法对61例nsclc及20例肺良性瘤样病变周围正常组织中pakt、vegf的表达进行检测，观察肺癌及正常组织中pakt、vegf的表达及与临床病理各因素相互关系，分析nsclc中pakt、vegf之间的相关性。结果 nsclc中pakt蛋白阳性表达44.3%(27/61)，明显高于正常组织0%(0/20)(χ2=13.28,p<0.05),其蛋白表达与肿瘤分化程度明显相关。vegf在nsclc及正常组织中的阳性表达率分别为61.6%(37/61)和25%(5/20)，二者差异显著(χ2=5.70，p<0.05)，vegf的表达与tnm分期、组织类型、淋巴结转移明显相关。pakt与vegf的表达明显相关。结论 nsclc中pakt的表达明显增高，其过表达与vegf相关，pakt对肺癌血管生成的调节可能与上调vegf有关。

【关键词】 非小细胞肺癌;蛋白激酶b;血管内皮生长因子;血管生成

akt蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因与蛋白激酶a(pka)和蛋白激酶c(pkc)在结构上很相似，因此，又被命名为蛋白激酶b(pkb)，其功能的发挥有赖于位点的磷酸化。研究发现,在许多人类肿瘤中存在akt频繁激活,并通过磷酸化其下游的多种作用底物促进肿瘤血管生成、细胞的侵袭、转移〔1〕。而肿瘤的生长必须有新生血管提供营养，血管内皮生长因子(vegf)可以改变内皮细胞基因的活化，诱导血管的形成〔2〕;akt可以通过多种途径促进血管的生成。目前关于磷酸化蛋白激酶b(pakt)在肺癌中表达的报道甚少，尤其是肺癌组织中akt活化与肿瘤血管生成的研究鲜见报道。我们通过观察肺癌组织和正常肺组织中pakt、vegf的表达，探讨akt的活化与肿瘤的发生发展及其血管生成的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 标本来源于山东大学齐鲁医院病理科，均为该院2004年6月至2006年6月经常规病理切片证实的非小细胞肺癌(nsclc)61例，男40 例，女21例，年龄34～79岁，平均60.0岁。依据1997年新的修订标准进行tnm分期〔3〕,其中ⅰ期15例，ⅱ期15例，ⅲ期24例，ⅳ期7例;按病理形态学分为：鳞状细胞癌32例，腺癌29例;按分化程度分为：高分化4例,中分化24例，低未分化33例;按有无淋巴结转移分为：有淋巴结转移32例，无淋巴结转移29例;患者均为原发性肺癌，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗;肺癌组织取自肿块中央非坏死部分。取肺良性瘤样病变周围5 cm以上正常组织20例，其中结核球8例，肺平滑肌瘤2例，错构瘤3例，炎性假瘤7例;所有标本术后均经he染色法重复染色，由两位病理医生会诊后确诊;标本经10%福尔马林固定，常规脱水石蜡包埋。

　　1.2 主要试剂及检测方法 pakt兔抗人单克隆抗体由美国cell signaling生物技术有限公司提供，工作浓度为1∶50;vegf鼠抗人单克隆抗体及sp试剂盒均为即用型由北京中山生物技术有限公司提供。将标本制成4 μm厚连续石蜡切片，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(sp)免疫组织化学方法染色，用pbs代替一抗作为阴性对照，步骤按说明书。

　　1.3 结果判断及统计学处理 光学显微镜下观察pakt阳性蛋白为细胞浆染色呈淡黄色至棕黄色，pakt按着色细胞百分数计分〔4〕：0%记为0分，1%～50%记为1分，51%～100%记为2分。按染色强度计分：细胞未染色0分，染色较弱为1分，中度染色为2分，强染色为3分。最后以阳性细胞的百分比记分和染色强度记分之和进行结果判定：0～2分为阴性(-),3～5分为阳性(+)。vegf按照vlom等〔5〕的评判标准：选染色均匀的癌间质区，在400倍视野下，以着色细胞占视野细胞总数的多少分为0～3级。0级：0;1级：<25%;2级：26%～50%;3级：>50%。0级为阴性，1级以上为阳性。

　　1.4 统计学处理 数据用率(%)表示，采用χ2检验，用spss10.0软件进行统计学分析。

　　2 结 果

　　2.1 肺癌、肺良性病变组织中pakt、vegf的表达 pakt蛋白表达阳性染色主要定位于肺癌细胞胞浆中，为粗细不一的棕黄色颗粒，在61例肺癌组织中27例pakt蛋白表达阳性，20例正常肺组织中未见pakt蛋白的表达。61例nsclc组织中pakt蛋白表达(44.3%)明显高于癌旁组织(0%)，二者有显著性差异(p<0.05)。vegf阳性物为棕黄色颗粒状，主要位于肿瘤细胞的胞浆中，以肿瘤组织周边部位及坏死区域周围肿瘤细胞表达较强，肺癌组织内巨噬细胞、部分血管内皮细胞及成纤维细胞也呈阳性。本组61例nsclc中，vegf阳性37例，阳性率61.6 %，20例正常肺组织中5例阳性，阳性表达率25%，两者之间有显著性差异(p<0.05)，见图1。

　　2.2 pakt、vegf表达与肺癌患者临床病理特征的关系 肺癌组织中pakt蛋白表达与患者的年龄、性别、吸烟、组织类型、tnm分期及淋巴结转移等无明显关系，而与肿瘤的分化程度明显相关。vegf的表达与患者的年龄、性别、吸烟及肿瘤的分化程度等无明显关系;而与tnm分期、组织类型、淋巴结转移明显相关，见表1。表1 不同蛋白表达与nsclc临床病理特征的关系

　　2.3 肺癌组织中pakt、vegf表达的相互关系 在27例pakt阳性病例中vegf阳性22例，阴性5例，而在37例vegf阳性病例中，pakt阳性22例，阴性15例。经统计学检验表明，二者呈正相关关系(r=0.38，p<0.05)。

　　3 讨 论

　　akt是pi3k/akt信号转导途径中的关键蛋白，在细胞的凋亡、存活、增殖等活动中发挥重要作用。akt的激活与多种肿瘤的发生密切相关，在多种肿瘤组织中都有akt的过度表达和活化。研究表明pakt在nsclc中的阳性率为41.2%，而在正常肺组织中的阳性率为0%〔6〕，balsara等〔7〕对25例支气管癌前病变标本进行检测，表明化生/增生不良部位表现出akt的活化，而正常和增生支气管上皮未检出活性akt的表达。本结果显示不同性质的肺病变组织中pakt蛋白的表达水平不同，在肺癌组织中有较高的阳性表达，与上述研究基本一致，提示akt的活化可能在肺癌的发生中起重要作用，并可能成为一个新的肺癌诊断标志。

　　目前对活化akt与肿瘤临床病理特征关系的研究报道不一〔8，9〕，我们的研究结果显示：肺癌组织中pakt蛋白表达与患者的年龄、性别、吸烟、组织类型、tnm分期及淋巴结转移等无明显关系，而与肿瘤的分化程度明显相关，分化越差、恶性程度越高，pakt蛋白的表达愈高。目前对akt与肿瘤临床病理特征关系结论不一，有待于进一步扩大样本量及预后随访。

　　最近有研究表明〔10〕,akt磷酸化以后可以激活一氧化氮合酶导致新生血管形成,促进vegf诱导的内皮细胞迁移。在乳腺癌和前列腺癌细胞中akt激活以后，可以通过hif1α调节vegf的表达。slomiany〔11〕等在对头颈部鳞状细胞癌的研究中发现，在scc9细胞中，igfi可以通过pi3k/akt/mtor途径刺激vegf的分泌及vegf启动子的激活。kobayashi〔10〕等研究表明经过akt抑制剂ly294002处理的胃癌细胞vegf蛋白的分泌明显下降,而在胃癌组织中，vegf的高表达与pakt有明显的相关性。但是未见对肺癌组织pakt和血管生成关系的研究，因此我们检测了vegf，以探讨akt的活化是否与肺癌的血管生成相关，结果表明，肺癌组织中pakt与vegf的表达有明显的相关性。结合以上细胞和其他肿瘤组织中的研究结果及其机制,我们推测,在肺癌中可能存在akt/vegf通路，在肺癌中,akt活化以后,一方面促进细胞的增殖,抑制细胞的调亡,增加细胞的运动能力;另一方面可以促进vegf的表达和分泌，导致肿瘤新血管的生成，增加肿瘤的血供,从而为肺癌的发展和转移创造条件,两方面相互协调促进肺癌早期发生转移。而且akt可能是众多因子调控vegf表达通路中的关键蛋白,处于调节血管生成的中心环节，一氧化氮合酶、hif1α、 igfi等对vegf的调节作用均与akt活化密切相关,因而通过打断pi3k/akt通路或者抑制akt的活化有可能抑制肿瘤新生血管的生成，从而抑制肿瘤的侵袭和转移，可为肺癌的治疗提供新的方法。

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