基因技术治疗肿瘤，基因芯片生物医学主要应用

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【摘要】 目的 运用基因芯片技术研究骨巨细胞瘤差异性基因表达。方法 提取手术切除新鲜gctb标本8例及4例正常骨痂的细胞总 rna，应用含有8064个人类基因点的 cdna 表达谱芯片基因芯片筛选差异性表达基因, amersham pharmacia genⅲ扫描杂交信号，用image quant软件分析实验结果。 结果 8例骨巨细胞瘤患者与正常人群相比较基因表达差异的比例约占总数的26%，两者间的基因表达差异具有统计学意义（p<0.01），表达差异五倍以上的基因47个,其中25个基因表达明显上调,22个基因表达明显下调，以细胞外基质调节基因、肿瘤相关基因、细胞因子类基因为主要类别。结论 基因芯片技术对骨巨细胞瘤分子水平病理机制研究有重要意义，为其诊断治疗进一步提供了线索。

【关键词】 基因芯片 骨巨细胞瘤 基因 差异性

基因芯片技术是近年发展起来的一项新技术，可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析，从而高效快捷地测试和分析基因、配体、抗原等生物活性物质。骨巨细胞瘤为好发于青少年长骨干骺端的低度恶性或潜在恶性肿瘤，生物学行为多变，故其治疗效果往往欠佳；至今其发病机制仍未清楚。本研究利用基因芯片技术鉴别骨巨细胞瘤差异表达基因谱，进而探索研究骨巨细胞瘤分子水平致病机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和软件

eppendorf台式微型离心机(eppendorf ltd.)、eppendorf 5810r 冷冻桌面离心机 (eppendorf ltd.)、gen iii microarray spotter 芯片点样仪(amersham pharmacia biotech ltd.)、generation ⅲ array scanner芯片扫描仪(amersham pharmacia biotech ltd.)、shellab general purpose incubator恒温杂交箱(shellab ltd.)、biorad minisub gt system电泳设备(biorad ltd.)、du520 uv/vis spectrophotometer紫外分光光度计（beckman coulter ltd.）、vilber gel documentation system凝胶成像仪(vilber ltd.)、uv crosslinker（viber lourmat france）紫外交联仪、midas 8064点基因芯片（chipscreen biosciences ltd.）、图像扫描软件image quant (amersham pharmacia biotech ltd.)、图像分析软件array vision 6.0(imaging research ltd.)、实时荧光定量pcr通用系统（abi）。

1.2 实验试剂

trizol reagent (life technologies, inc.)、qiagene rneasy mini kit (qiagen, inc.)、qiagene pcr purification kit (qiagen, inc.)、ambion messageamp arna kit (ambion, inc.)、cyscribe cdna labeling kit (amersham pharmacia biotech, ltd)。

1.3 标本采集分组及rna提取

取自2002～2004年本院及广州华侨医院、 中山大学附属一院手术切除新鲜标本8例(术中判断及术后病理证实为gctb), jaffe: i级6例、 ii级1例、 ⅲ级1例； campanacci分级: i级6例、 ii级1例、 ⅲ级1例； enneking分期: g0t1～2m0 5例、 g1t1～2m0 2例、 g2t2m0 1例； 部位: 股骨远端5例、 胫骨近端2例、 桡骨远端1例； 年龄23～55岁， 平均34岁； 男5例、 女3例。 对照组4例， 取自胫骨和股骨骨折内固定取出术中的正常骨痂， 男女各2例、 年龄23～50岁， 平均30岁。 所有标本均分成约1cm×1cm×1cm小块, 于离体30min内保存于液氮中。 组织样品加入适量体积的trizol后采用自动匀浆器至完全匀浆， 加入适量的氯仿、 rw1、 rpe溶液、 depc水按步骤离心， 以3m乙酸钠静置至沉淀后加入适量depc水溶解沉淀， 测定rna样品浓度和总量， 取样品琼脂糖凝胶电泳鉴定rna的质量并将合格样品保存于－80℃归档（浓度达试验要求的20μg量, 其ａ260/ａ280比值不低于1.8）。

1.4 实验方法

1.4.1 探针标记 样品rna和second round prime、spike rna在70℃混合变性、冷却各5min后，在42℃条件下和0.1m dtt、dyedctp、dntp mix等反应2h，反应完毕后采用qia quick pcr purification kit纯化，加入适量buffer pb混匀后逐步离心，可得57μl产物。

1.4.2 预杂交或预处理 将放入玻片的片夹放入200～250ml预热至55℃预杂交缓冲液的染色缸,置于摇床上于室温缓慢摇晃20～30min；取出并立刻甩干片夹内玻片，用气罐轻轻吹至其完全干燥。

1.4.3 探针制备及杂交 将标记好的探针(cy3/cy5)按等量混匀(各40pmol)抽干后，按顺序加入下列试剂：杂交缓冲液7.5μl、甲酰胺15μl、灭菌水至总体积30μl，充分溶解并混匀后短暂离心，95℃水浴5min，立刻置于冰上1min，振荡混匀后短暂离心，将混好的探针铺在基因芯片有样品的一侧，然后再将盖玻片放上，并放置于42℃孵箱中16h。

1.4.4 洗片 杂交结束后，取出玻片置于片夹内放入预先放满去离子水的染色缸中，让其垂直并自然滑落；取出片夹，迅速放入另一个预先盛有200～250ml预热至55℃的0.1% ssc洗脱液染色缸中，在摇床上于室温缓慢摇晃20min；取出片夹，再重复洗涤一次后取出并立刻甩干片夹内玻片，用气罐轻轻吹至其完全干燥。

1.4.5 扫描和数据处理 将完全干燥的玻片放入扫描片夹中用扫描仪进行扫描，将图像转化为基于荧光强度的数字信号，进行数据分析和处理。

1.4.6 杂交信号分析和标准 杂交信号强度为每个荧光通道扫描数据，包括每个基因点的扫描数值(volrfu)扣除背景数值(bkgd)后的实际数值(svol)，可用以初步估计该基因在每个样品中的表达水平及每个基因数据的有效性。将荧光信号通过lowess方法归一化后以比值（ratio）表示基因表达量在实验组（肿瘤组）和对照组间的变化倍数（大于1的数值代表相应基因表达量上调倍数，小于1的数值则代表相应基因表达量下调，以该数值倒数的负值来表示）；对于基因表达变化的显著性，对于在两个通道上的荧光信号均符合有效信号标准的数据采用上下2倍变化的标准；对于仅在其中一个通道上具有有效杂交信号的数据，表达变化显著性的标准调整为上下3倍。

1.4.7 杂交及检测偏差的控制 与荧光标记杂交的基因表达谱芯片为8064位点全长cdna芯片，共有7488个克隆片段，其中7458个为表达基因片段，长度在500个碱基对以上（平均长度为1.4kb）；其他30个为空白载体片段。包括120个外参照标准基因和132个内参照标准基因以及其他阴性和阳性对照基因共384个基因，每个对照基因在芯片上重复点样12次。

1.5 统计学方法

采用spss 11.5统计分析软件，对计量资料进行卡方检验，检验水准α=0.05，当p<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访结果

8例中行病灶刮除、自体或异体骨植骨术4例，行瘤段边缘切除、人工关节置换术4例，均获回访至今，平均32个月，复发一例，未发现肺转移。

2.2 骨巨细胞瘤患者差异性基因表达

在8000多个基因点中, 8例骨巨细胞瘤患者与正常人群相比较基因表达差异的比例约占总数的26%，两者间的基因表达差异具有统计学意义（p<0.01），反映出除去实验误差可能造成的影响外，两者间存在明显的生物来源性质差异（个体差异性及病理生理特性的差异）。其表达差异基因主要有细胞因子及受体基因、转录相关基因、凋亡相关基因、生长分化相关基因、信号转导相关基因、细胞周期相关基因、电子传递和氧化相关基因、转移酶相关基因、核酸酶相关基因等，其中差异表达5倍以上的基因47个, 25个基因表达明显上调,22个基因表达明显下调。我们对此具有明显功能特征的基因数据进行了初步分析，其归类主要包括细胞外基质调节基因、肿瘤相关基因、细胞增殖与凋亡调控基因、细胞因子类基因，见表1～3。

1例病人（jaffe ⅲ级、campanacci分级 ⅲ级、g2t2m0）于2004年6月行作胫骨囊内刮除、自体骨植骨术，近期症状复发，xray检查发现植骨区密度明显下降，囊壁较术前扩大，骨皮质出现破坏，有肿瘤复发迹象，肺部无明显异常，其基因谱里差异性上调明显表达者为mmp13、tnfrsf11b；差异性下调表达明显为scyd1、mmp3基因，见图1～3。表1a 与细胞外基质组成及转换相关的差异性上调表达基因 表1b 与细胞外基质组成及转换相关的差异性下调表达基因 表2a 差异性上调表达的肿瘤相关基因 (6个)表2b 差异性下调表达的肿瘤相关基因 (6个)表3a 差异性上调表达的细胞因子及受体类基因 (7个)表3b 差异性下调表达的细胞因子及受体类基因 (6个)

3 讨论

骨巨细胞瘤是好发于20～40岁人群的原发性骨肿瘤，我国的发病率高达18.4%以上，为西方国家2～3 倍[1]。因其组织来源未定,生物学行为复杂而多变,故临床治疗后易复发[2]。目前的分级方法及分期原则均不能完全准确反映其恶性程度、转移及复发倾向。依靠巨细胞的数量和肿瘤基质细胞组织学特征对骨巨细胞瘤的jaffe 分级，经长期临床观察此类标准与肿瘤生物学行为不平行，虽然在一定程度上反映了肿瘤细胞的侵袭性,但因jaffe分级本身主观性强,且术前穿刺标本及病理取材本身具局限性,特别是ⅱ级和 ⅲ级间界限不明确, i、ii级者也存在一定的复发和转移率，用以指导治疗的预后价值有限[3]。肿瘤影像学campanacci分级标准和肿瘤复发也无相关性[4], 相当一部分患者影像学呈现极强的侵袭性,而病理学jaffe分级为ⅰ级[5];enneking肌肉骨骼系统肿瘤分期经组织学、肿瘤大小及远处转移三方面确立后行边缘或大于边缘的外科边界治疗，传统的标准治疗方法是肿瘤的刮除,用自体髂骨填充刮除肿瘤后遗留的空腔，这种瘤内切除方法只能达到囊内的外科边界,其局部复发率可高达40%～60%[2]，故对骨巨细胞瘤行边缘或广泛切除治疗是必要的，彻底切除可能降低肿瘤的复发率,但带来一些缺损修复及功能恢复的问题。因此临床上为弥补各自缺陷多采用此三种方法综合分析骨巨细胞瘤的属性和病变程度以指导选择合适的治疗方案。但是这种综合方法价值有限。已有多例报告指出，综合分析法定性为典型良性骨巨细胞瘤，术后半年却发生肺部广泛转移而死亡[6]。

基因芯片技术可直接检测mrna 的种类及丰富度，是研究基因表达的有力工具，我们尝试通过基因芯片技术进行探讨骨巨细胞瘤的肿瘤发生机制，并力图寻求分子水平的骨巨细胞瘤分级方法。选取典型骨巨细胞瘤样本，以正常人骨组织作为对照，应用人类全长基因表达谱芯片可以得到骨巨细胞瘤特异性基因表达谱，从而获得肿瘤组织中差异表达显著的基因，筛选出肿瘤发生以及恶化过程中起重要作用的相关基因或基因群，建立起肿瘤发展过程中呈时间梯度的基因表达谱。通过此表达谱监测发生显著改变的某些基因以其表达程度进行诊断和预测骨巨细胞瘤的发生定性、转归等，为治疗方案的选择提供指导。

本研究中应用基因芯片技术成功获得骨巨细胞瘤区和正常骨的基因表达谱及基因表达差异图，初步筛选出表达变化显著具有特定功能的基因群，证明应用基因芯片技术进行骨巨细胞瘤基因表达谱的研究是可行的。如mmp13基因在软骨的形成过程中发挥重要作用是骨性关节炎中破坏降解软骨的关键性因素，在本研究中该基因呈明显表达上调，符合对该基因目前的研究认识；而tnfrsf11b是骨保护素基因，能够促进破骨细胞活性而在骨质疏松研究中益显重要，它主要表达于淋巴细胞、骨髓基质和成骨旺盛的骨骼区[7]，能够激活破骨细胞，在老鼠体内注射骨保护素能够造成高钙血症[8]，骨保护素配体（opgl）能够强化淋巴结树突状细胞（dcs）功能促使t致敏而产生破骨细胞源性因子[9]，近期还发现干扰素通过影响骨保护素配体（opgl）信号转导而阻止破骨细胞分化[10] ，在本研究中该基因呈明显表达上调符合实验预期，但是这些基因表达动态和疾病转归有待继续观察。

我们认为肿瘤发生和发展是一个复杂的多阶段过程，当参与调控细胞增殖、分化和衰亡即凋亡等基本生命过程的多种肿瘤相关基因相继或同时发生突变、重排、缺失、扩增而被异常激活或失活时，正常的受控增殖、分化或凋亡受到干扰，于是细胞无限增殖、分化受阻或寿命延长而形成肿瘤。 要了解整个癌变过程中的基因改变，以至癌变在各个阶段中细胞全部基因表达的动态变化，需要研究的不是一个或几个基因而是整个基因组从正常到肿瘤各个阶段中上千个基因表达的动态变化。 因此利用基因表达谱数据可以较全面获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤相关基因表达的相关模型。

在未来研究中通过此项技术将良性、恶性的骨巨细胞瘤基因表达谱进行聚类分析，进而建立骨巨细胞瘤定性分级的分子标准，将是研究的重点方向。

【参考文献】 ［1］ 武忠弼,杨光华.中华外科病理学[m].北京:人民卫生出版社,2002.22752280.［2］ prosser gh, baloch kg, tillman rm, et al. does curettage without adjuvant therapy provide low recurrence rates in giantcell tumors of bone？[j]. clin orthop relat res,2005,435（6）: 211218.［3］ 马庆军,党耕町.骨巨细胞瘤诊断与治疗研究现状[j].中华外科杂志,2005,43（12）: 819821.［4］ lackman rd,hosalkar hs,ogilvie esional curettage for grades ii and iii giant cell tumors of bone[j]. clin orthop relat res, 2005,438(9):123127.[5] lausten gs,jensen pk,schiodt t, et recurrences in giant cell tumour of bone: longterm follow up of 31 cases[j]. int orthop, 1996, 20(3): 172176.[6] ghert ma, rizzo m, harrelson jm, et cell tumor in the appendicular skeleton[j]. clin orthop relat res,2002,400(7):201210.[7] logar db, komadina r, prezelj j, et al. expression of bone resorption genes in osteoarthritis and osteoporosis[j]. j bone miner metab, 2007, 25(4):219225. [8] lacey dl,timms ei,tan hl, et roteger ligand is a cytokine that regulates osteoclast diffierentiation and activation[j].cell,1998，93(2):165176.[9] kong yy, feige u, sarosi i,et al. activated t cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand[j].nature, 1999, 402（6759）:304309.[10]takayanag h, kim s，matsuo k, et maintains bone homeostasis through cfosdependent induction of interferonbeta[j]. nature, 2002,418(6882):744749.

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