作者：李妍，鞠晓红，任旷，李强，钟越
【摘要】 目的分析4种不同中药单体对非小细胞肺癌spca-1的生长抑制作用，为其临床应用提供实验依据。方法采用wst-1还原法分析不同浓度斑蝥素(2.5，5.0，10，20 mg/ml)、去甲基斑蝥素(2.5，5.0，10，20 mg/ml)、β-榄香烯(5，10，20，40 mg/ml)和大黄素(10，20，40，80 mg/ml)对spca-1细胞生长增殖的影响。结果β-榄香烯、斑蝥素、去甲斑蝥素和大黄素均能抑制非小细胞肺癌增殖，且呈剂量依赖性，其中去甲斑蝥素的抗肿瘤活性最强，ic50为(7.62±1.35) mg/l。结论4种中药单体成分均能抑制肿瘤细胞spca-1的生长增殖，其中显著导致细胞生长抑制的是去甲基斑蝥素和斑蝥素。
【关键词】 肿瘤; 中药; 斑蝥素; β-榄香烯; 大黄素; 去甲基斑蝥素
肺癌是常见的恶性肿瘤,其发病率、病死率在我国居前列，其中非小细胞肺癌的预后比较差。尽管现在的治疗不断取得进展，生存率提高得还是很少[1]。寻找有效的抗癌药物成为肿瘤治疗领域的重要研究内容。中医药在肿瘤治疗中的应用日益受到关注。随着中药有效组分分离、纯化和结构修饰技术的进步，从中药中寻找高效、低毒的抗癌成分已经成为新药开发的重要途径。筛选肺癌细胞敏感的中药单体成分，将有助于推动中药在肺癌治疗中的应用，改进肺癌的治疗效果。本实验分析了4种不同的中药单体对非小细胞肺癌spca-1的生长抑制作用，以期为临床治疗非小细胞肺癌提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料肺癌细胞株spca-1购自美国典型生物收藏中心(american type culture collection ，atcc)。rpmi-1640培养液购自sigma公司，小牛血清购自黄岩四季青生物试剂有限公司。斑蝥素和去甲基斑蝥素购自大连市医药科学研究所，β-榄香烯购自大连金港制药厂，大黄素购自复旦大学药学院天然药物研究所。wst-1细胞增殖检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司。
1.2 细胞培养 spca-1细胞用含10%小牛血清的rpmi1640培养液，在37℃，5% co2，饱和湿度的条件下连续传代培养，2 d更换1次培养液，实验时取对数生长期细胞。
1.3 细胞增殖检测取对数生长期细胞，用0.05%胰酶和0.02 % edta消化，1 000 r/min离心5 min收集细胞，调细胞密度为2×104/ml，接种于96孔板，100 μl/孔。待细胞贴壁生长后，分别加入β-榄香烯、斑蝥素、去甲斑蝥素和大黄素4种中药成分至终浓度，液体总量200 μl/孔，每组做4复孔，为实验组(t)。另外设置不加药物的对照组(c) 和不加wst-1溶液的空白对照组(b)。继续培养72 h，参照 wst-1试剂盒说明，检测4种中药单体对细胞增殖抑制的作用。简言之：除空白对照孔外，每孔加入wst-1溶液20 ml，在37℃培养2 h后，酶联检测仪检测450 nm的吸光度值(a450)。按下列公式计算细胞增殖抑制率(inhibition rate )，并以3次独立生物学实验的平均值表示最终实验结果。绘制药物浓度-细胞生长曲线，计算抑制50%细胞生长的药物浓度(inhibitory concentration 50%,ic50)。
细胞增殖抑制率(%)=[1-(a450t-a450b)/(a450c-a450b) ]×100%
1.4 形态学观察对数生长期细胞分别加入不同浓度β-榄香烯、斑蝥素、去甲斑蝥素和大黄素继续培养72 h后，收集细胞，光镜下观察、拍照。
2 结果
2.1 4种药物对细胞的抑制作用去甲斑蝥素、斑蝥素、β-榄香烯和大黄素对spca-1细胞的抑制作用见图1。去甲斑蝥素，斑蝥素，β-榄香烯和大黄素均能抑制spca-1细胞增殖，并呈剂量依赖性，其中去甲斑蝥素的抗肿瘤作用最显著， ic50为7.62±1.35 mg/l, 其次为斑蝥素，ic50为(9.14±1.69) mg/l, β-榄香烯和大黄素的ic50分别为(16.71±3.54) mg/l和(23.65±3.87) mg/l。
2.2 药物作用下细胞形态学变化不同中药单体作用24 h，光镜下观察生长状况和细胞形态的变化。与对照组相比，随着去甲斑蝥素浓度的增加，视野中细胞的数量减少，即细胞生长受抑制;同时非贴壁细胞的圆形细胞(g2/m期细胞)比例增加，斑蝥素对细胞生长和形态影响与去甲斑蝥素相似(见图2);β-榄香烯随着浓度的增加，视野中细胞的数量减少，即细胞生长受抑制;同时细胞膜起泡和核皱缩的细胞(凋亡细胞)比例增加;大黄素对细胞生长抑制作用也随药物浓度增加而增强(见图3)。
3 讨论
中药治疗肿瘤已取得了较好效果，愈来愈受到国内外的关注。我国中药资源丰富，从中寻找抗癌活性成分是新药开发的良好途径。在各种恶性肿瘤中，非小细胞肺癌是发病率最高的肿瘤，传统的手术切除、放疗、化疗是主要的治疗方法，但治疗结果往往难令人满意。筛选有效的中药成分单独应用或与化疗药物联合应用，可能为非小细胞肺癌的治疗提供新的选择和契机。
斑蝥素是广泛存在于一千五百多种斑蝥体内的一种天然防御性毒素，能抑制蛋白磷酸酯酶1 (pp1)和蛋白磷酸酯酶2a (pp2a)的活性、增强p53的功能，并能影响肿瘤细胞蛋白质的合成过程，医治疾病已有二千多年的历史[2]。去甲斑蝥素是我国研制合成的斑蝥素衍生物，与斑蝥素相比，少了2，3位甲基，毒副作用大大降低,对肺癌、肝癌、结肠癌、胆囊癌和乳腺癌等有明显抑制作用[3，4]。去甲斑蝥素抗癌作用机制是多方面的，越来越多的实验结果显示去甲斑蝥素可通过抑制血管生成从而达到抑制肿瘤生长的作用[5～7]，进一步提示去甲斑蝥素在肿瘤治疗中的潜在价值。β-榄香烯是从中药温莪术挥发油中提取的萜烯类化合物，而大黄素为中药大黄中提纯的蒽醌类衍生物。体外研究表明，β-榄香烯和大黄素均对肝癌、结肠癌、乳腺癌和宫颈癌细胞有一定的抑制作用。用细胞生物学和分子生物学技术阐明中药的作用机制是促进其应用的前提，我们以非小细胞肺癌spc-a-1 为模型，比较研究斑蝥素、去甲斑蝥素、β-榄香烯和大黄4种中药成分的抗肿瘤活性以及作用机制。
本实验结果表明，斑蝥素、去甲斑蝥素、β-榄香烯和大黄素对spca-1细胞增殖均有抑制效应，其中去甲斑蝥素的抗肿瘤活性最强，ic50值为(7.62±1.35) mg/l。细胞增殖过剩和细胞凋亡下降是恶性肿瘤形成的原因，分析抗肿瘤制剂对细胞周期和细胞凋亡的影响是研究其抗癌机制的关键指标。4种中药成分均能诱导一定程度的细胞凋亡，斑蝥素和去甲斑蝥素显著的导致g2/m期的阻滞，而b-榄香烯和大黄使细胞阻滞于g1期和s1期。通过上述指标的分析表明，斑蝥素和去甲斑蝥素抑制spca-1增殖主要与有丝分裂阻滞和诱导细胞凋亡有关;而β-榄香烯和大黄可能主要作用于g1和s期。调控细胞周期和细胞凋亡的机制复杂，上述中药成分影响肿瘤细胞周期、诱导细胞凋亡的分子机制还有待于进一步研究探索。
【参考文献】
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