【摘要】 目的研究黄芪香丹红花注射液对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， mscs)增殖的影响。方法体外加药培养mscs，用四甲基偶氮唑法检测黄芪香丹红花注射液促进大鼠mscs的增殖作用，免疫组化检测mscs细胞的5溴尿嘧啶核苷(brdu)标记阳性率。结果发现香丹药液对mscs的增殖与对照组比较有显著性差异;而红花、黄芪药液对mscs的增殖无显著作用。结论香丹注射液有促进mscs增殖的作用。
【关键词】 黄芪注射液； 红花注射液； 香丹注射液； 骨髓间充质干细胞； 细胞增殖
abstract：objectiveto investigate the effect of astragali，flos carthami， salvia miltiorrhiza injection on the proliferation of mesenchymal stem cells. (mscs).methodsmscs of the 3th generation were selected for induction with injection in five consistency in vitro. mscs were marked by brdu. the proliferation of mesenchymal stem cell were detected by mtt and immuno cytochemistry. resultsin salvia miltiorrhiza group，mscs proliferation in three higher concentration groups of five increased compared with control group (p<0. 05) in vitro, but didn't increase obviously in astragali， flos carthami groups(p> 0. 05) in sionsalvia miltiorrhiza can improve proliferation of mscs.
key words： flos carthami； astragali； salvia miltiorrhiza injection； mesenchymal stem cells； cell proliferation
骨髓间充质干细胞（mscs）已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点，具有取材方便、体内可以随血液循环到受损伤部位参与修复损伤的优点 ［1，2］。我国中药有近两千年的历史，资源丰富，在这些中药中可能有大量的能够促进干细胞增殖、分化的药物。黄芪、红花、香丹均是具有活血化淤，通脉养心、抗凝、扩血管、改善微循环、抗氧化等功效的中药。为了探讨活血化淤、通脉养心类中药对干细胞增殖的影响，本研究组通过体外实验研究了几种单味中药对骨髓间充质干细胞增殖的影响。现报道如下。
1 材料与仪器
sd大鼠(青海地方病实验动物中心) 。淋巴细胞分离液(上海试剂二厂) ；l dmem(gibcobrl公司) ；胰蛋白酶(sigma公司) ;四甲基偶氮唑(mmt) 、5溴尿嘧啶核苷(b rdu) 、二甲基亚砜(sigma公司) ；黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂，批准文号z51021775），红花注射液（太原华卫药业有限公司，批准文号z14020008），香丹注射液(四川川大华西药业股份有限公司，批准文号z51022348) 。生物素山羊抗大鼠igg(博士德二抗试盒) ；dab显色剂(博士德生物工程有限公司) 。酶标仪(美国) 。
2 方法
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养取体质量200 g sd大鼠的股骨和胫骨，用dmem冲出骨髓。将冲出的骨髓和dmem混合液离心(1. 5 ×103 r·min- 1) 5 min，去上清液后，用dmem制成悬液。用吸管沿管壁将悬液慢慢加入已装有4 ml分离液的离心管中，使两种溶液间有明显的界面， 1.9 ×103 r·min- 1水平离心20 min。用吸管小心吸取中层白色雾状的细胞层，无血清dmem液洗涤两次，然后用含15%小牛血清的dmem培养液重悬， 5 ×105·ml- 1接种， 37℃、5%co2 孵箱培养。第5天，第1次换液，此后每7 d换液两次。
2.2 加药培养待细胞接近融合时，按1 ×104·ml- 1传代，传至第3代时，将细胞浓度调为2 ×105·ml- 1 ，接种于96孔板(每孔100 μl) ，培养24 h；吸去上清液,每孔加不含血清的dmem溶液100 μl，培养24 h；吸去上清液，每孔加100 μl含15%小牛血清的dmem培养液，同时分别加入黄芪、红花、香丹注射液(药物浓度梯度为：原液，5，10，15，20倍液）每孔70 μl，每个浓度3个重复孔。3个阴性对照孔加等量的生理盐水，培养24，48 h，用mtt法检测3种注射液和生理盐水对细胞的增殖作用。
2.3 mtt检测24，48 h后，吸去培养液，每孔加20μlmtt溶液孵育4 h，吸出mtt；再加入200 μl二甲基亚砜，用酶联检测仪于490 nm测定吸光度。结果见表1。
2.4 细胞爬片的制备将细胞浓度调整为2×105/ml，接种与预先放有玻片的24孔板（1 ml/孔），培养24 h后，将上清吸去，加不含血清的dmem溶液1ml/孔，培养24 h后，吸去上清，每孔加0.59 ml含15%胎牛血清的dmem培养液以及brdu，同时加入黄芪注射液、红花注射液、香丹注射液（浓度梯度为：原液，5，10，15，20倍）各0.41 ml/孔，对照组加0.41ml/孔的生理盐水，1个浓度3个重复孔。使每孔brdu的终浓度为10 μg/ml。
2.5 brdu表达的检测培养48 h后，吸去培养液，用 carnoy液固定细胞10，自然干燥。3%h2o2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，pbs 浸泡5 min。5%～10%正常山羊血清（pbs稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加适当稀释的brdu抗体（1∶200），37℃孵育2 h，pbs冲洗，5 min×3次。滴加生物素人抗大鼠igg，37℃孵育20 min。pbs冲洗，5 min×3次。dab显色 5 min 每张片镜下随机选取10个视野计数阳性细胞数，取平均值。结果见表2。
2.6 统计学分析本实验所有计量资料以±s表示，显著性检验采用方差分析，组间比较采用几个处理组均数与一个对照组均数比较的dunnett法。
3 结果
3.1 mtt法监测3种注射液对mscs增殖的影响表1显示香丹组的吸光度（od值）与生理盐水组比较有显著性差异， 24 h od值实验1至3组分别与对照组比较p值均小于0. 05，而实验3、4组与对照组比较p>0. 05 ；48 h od值实验1至3组分别与对照组比较p＜0.05，实验3、4组与对照组比较p>0. 05； 红花组、黄芪组，24，48 hod值与生理盐水组比较均无显著性差异。表1 3种注射液对mscs增殖的影响(略)
3.2 3种注射液对mscs brdu标记阳性细胞数的影响表2显示香丹1至3组的阳性细胞数与生理盐水组阳性细胞数比较有显著性差异（p<0.05），与mtt法检测的结果相一致。红花组、黄芪组的阳性细胞数与生理盐水组比较均无显著性差异（p>0.05）。表2 3种注射液对mscsbrdu标记阳性细胞数的影响(略)
4 讨论
如何促进mscs的增殖、分化，是目前mscs研究的重点和难点之一。
本研究拟选择了黄芪、香丹和红花3种注射液，进行体外药物培养mscs，观察他们促进mscs增殖效果。香丹注射液的主要成分丹参含抗氧化剂丹参酮及总胆酚酸。研究表明,丹参可改善微循环、增加脑组织atp含量、减轻缺血引起的脑水肿,部分抑制缺血后脑组织c-fos基因的表达、拮抗缺血后脑组织的单胺类介质、兴奋性氨基酸的异常变化［3］ 。也有研究表明，应用丹参后使全脑缺血后bcl-2免疫阳性细胞数明显增加，证实丹参能上调脑缺血后的bcl-2 表达，从而发挥其神经保护作用。本实验中我们用不同浓度的香丹注射液作用于mscs，发现3种浓度较高的药液对mscs的增殖有一定的促进作用，说明香丹注射液在一定浓度范围内促进mscs的增殖。黄芪是一种传统的益气药，具有免疫调节、抗菌利尿、强心等作用，祖国医学还认为黄芪有强化机体的作用，与其他中药配伍可以提高机体对创伤的恢复能力，增加受损部位的供血,有利于神经的再生［4］；红花具有活血通经、祛瘀止痛的功效，是传统的活血化瘀类中药［5 ］，现代药理学证明，红花可抑制血小板聚集，提高血液蛋白酶的活性，防止微血栓形成并对其有溶解作用，增加微循环血流量等作用［6 ］。在本实验中，我们用黄芪、红花注射液体外培养mscs，未发现这两种注射液对mscs的增殖有促进作用。虽然香丹、黄芪、红花注射液都是活血化淤，通脉养心类的中药制剂，但作用结果却不同，因此我们推测在实验所用的浓度范围内黄芪、红花对mscs的增殖无显著作用，是否在其他的浓度作用下会有影响还需要我们进一步的实验观察。
【参考文献】
［1］邢玉芝，杨玲麟，林洪，等.d半乳糖对大鼠骨髓间充质干细胞拟衰老作用的实验研究［j ］.中国修复重建外科杂志，2006，20 （4）：475.
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［3］崔桂云，沈 霞，张 璐，等.丹参神经保护作用机制的研究［j ］. 徐州医学院学报， 2002， 22 (6) : 492 .
［4］方有生，陈德松，顾玉东.党参黄芪丹参等复方中草药合剂对周围神经再生影响的实验研究［j ］. 中华手外科杂志， 1998， 14 (3) :181.
［5］薛腊梅，董幼平. 红花注射液治疗糖尿病周围神经病变［ j ］. 宁夏医学杂志，2001， 23 (6) : 367.
［6］孟凡迅，张沛云，程 纯，等.神经细胞培养法观察单味中药促神经生长的研究［j ］. 南通医学院学报，1999，19 (1) : 14.
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