作者：周娟，吴宏，刘青，捷明
【摘要】 目的 研究海带多糖体外抗氧化作用。方法 采用体外实验研究海带多糖对羟自由基、超氧阴离子的清除作用以及对 h2o2 诱导的红细胞氧化溶血和大鼠肝匀浆脂质过氧化的保护作用。结果 海带多糖体外可清除o-2· 及 ·oh; 抑制 h2o2 诱导的大鼠红细胞氧化性溶血; 抑制小鼠组织mda的生成。结论 海带多糖体外具有清除自由基及抗脂质过氧化的作用。
【关键词】 海带多糖;氧自由基;脂质过氧化;抗氧化
abstract:objective to study the antioxidative activities of laminarin in vitro. methods the antioxidant capacity of laminarin was investigated by in vitro assay. the scavenging effect of laminarin on oxygen radicals and its inhibitory effect on lipid peroxidation were studied. in addition,inhibiting effect of laminarin on h2o2 induced hemolysis of rat erythrocytes was studied as well. results laminarin exhibited a dosedependent inhibitory effect on the hydroxyl free radical and superoxide anion free radical. it also showed substantial antioxidant activity in homogenates of the mice liver and heart in a dosedependent manner. the autohaemolysis of mice red blood cells was blocked by laminarin in a dosedependent manner. conclusion laminarin shows antioxidant activity in experiments in vitro.
key words:laminarin; oxygen radical; lipid peroxide; antioxidation
海带属海带目海带科，含有多种生物活性成分，其大部分生物活性与其中的多糖成分密切相关[1]。海带多糖(laminarin)是从海带中提取出来的多糖类化合物。梁桂林[2]等对海带多糖进行体内抗氧化研究，结果表明海带多糖在体内具有抗氧化活性。本文对海带多糖的体外抗氧化作用进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
海带多糖的提取、纯化及纸层析鉴定法按文献[3]制备。将市售干海带适度粉碎,用蒸馏水浸泡,加热提取,冷却离心,浓缩,浓缩液加入4 倍体积的 95% 乙醇沉淀,沉淀物依次用无水乙醇、丙酮及乙醚洗涤,用蒸馏水复溶,透析,seveg 法除蛋白,常规干燥得海带多糖。纸层析分析表明,海带多糖由葡萄糖、半乳糖、木糖等组成。硫酸-苯酚法测多糖含量为 85%，考马司亮蓝法测定总蛋白含量。
硫代巴比妥酸购自国药集团化学试剂有限公司(批号：20080925);肝素为万邦医药(批号：0812111);抗坏血酸为福州海王福药制药有限公司产品(批号：0901042);硫酸亚铁、过氧化氢、三氯乙酸等均为市售分析纯试剂。
752n紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);tdl60b台式离心机 (上海安亭科学仪器厂);bs124s分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司) ;hhs数显恒温水浴锅(常州市国立试验设备研究所) ;xhc旋涡混合器(常州市国立试验设备研究所)。
实验动物为昆明种清洁级小鼠10只，体质量18～22 g，雌雄各半，由福州海王福药制药有限公司提供，许可证号：scxk(闽)20050003。
1.2 方法
1.2.1 海带多糖清除·oh 效果的测定 根据smirnoff 等的方法改进[4]，用feso4 + h2o2 产生·oh，以·oh 氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·oh 的多少，吸光值越大，·oh 越多。 4 ml 反应体系中含9 mmol/ l feso4 1 ml ，8.8 mmol/ l h2o2 1 ml ，9 mmol/ l水杨酸1 ml(用50%乙醇作溶剂)及1 ml 不同浓度的海带多糖，最后加h2o2 启动反应，37 ℃温浴1 h，于 510 nm 测吸光值。空白组以重蒸水代替水杨酸和海带多糖，对照组以重蒸水代替海带多糖。清除率以[a0-(ai-ai0)]/ a0 × 100% 计算，其中 a0 为对照，ai 为海带多糖某浓度时的吸光值，ai0为空白组的吸光值。
1.2.2 海带多糖清除o-2 效果的测定[5] 每支试管加trishcl缓冲液 (ph 8.2) 4.5 ml ，25 ℃ 预热 20 min ，加1 ml 不同浓度的海带多糖，再加10 mmol/ l 的邻苯三酚 0.4 ml ，立即摇匀，准确反应4 min ，立即加入8 mol/ l hcl 0.1 ml终止反应，325 nm 测吸光值。空白组以重蒸水代替邻苯三酚和海带多糖，对照组以重蒸水代替海带多糖。清除率以(a0-ai)/(a0-ai0)× 100%计算，其中a0为对照，ai为海带多糖某浓度时的吸光值，ai0为空白组的吸光值。
1.2.3 海带多糖对小鼠红细胞h2o2 所致溶血的影响[6] 小鼠颈总动脉采血，肝素抗凝，4 ℃ 3 000×g离心得红细胞，冷生理盐水洗 3 次，制成0.5% 悬浮液。取红细胞悬液 1 ml ,加不同浓度的海带多糖，最后加50 mmol/ l h2o2 0.5 ml混匀，37 ℃ 温浴1 h，加生理盐水 4 ml，3 000 r/min 离心5 min，取上清于415 nm测定其吸光值。正常组以生理盐水代替h2o2和海带多糖，模型组以生理盐水代替海带多糖。以模型组为100 %溶血，计算溶血度及抑制率。
1.2.4 海带多糖对生成 mda 抑制作用的测定 小鼠颈椎脱臼致死，迅速分离出肝组织和心组织，用冷的生理盐水洗净后称重，冰浴下匀浆，制成含蛋白质0.5%的悬浮液。
取5% 肝/心匀浆悬浮液0.2 ml，加入不同浓度海带多糖溶液1 ml，在37 ℃温浴1 h 后，加入20% tca 1 ml 终止反应,再加0.67% tba 1 ml，于沸水浴中显色15 min，冷却后离心，测532 nm上清液吸光度，以吸光度表示mda 含量的多少。对照组以重蒸水代替海带多糖，清除率以(a0-ai)/a0 × 100% 计算，其中为a0为对照，ai为海带多糖某浓度时的吸光值。
1.2.5 海带多糖对fe2+h2o2 诱导的小鼠肝线粒体中mda生成的影响 肝组织于在冰浴下以生理盐水制成10 %匀浆，2 000 r/ min 离心20 min，取上清液，以10 000 ×g 离心 20 min,沉淀用生理盐水洗涤 2 次后,以生理盐水配成吸光值在 0.5～0.6 的线粒体悬浮液[7]。取肝线粒体悬浮液 2.5 ml，加入不同浓度海带多糖 溶液0.4 ml，再加入1 mmol/ l feso4 0.1 ml，1 mmol/ l h2o2 0.1 ml，在37 ℃温浴1 h 后，取0. 1 ml 温育后的各管溶液，加入20 % tca 1 ml 终止反应，再加0.67% tba 1 ml，于沸水浴中显色15 min，冷却后离心，于532 nm 测上清液吸光值。对照组以重蒸水代替海带多糖，清除率如“1.2.4”计算。
1.3 统计学处理
实验结果以(±s)表示，进行组间t检验，以p<0.05为差异有显著性。
2 结果与分析
2.1 海带多糖对·oh 的清除作用
·oh 是活性氧中活性最高且造成损伤最大的一种，它可以与生物体内的多种分子作用， 造成糖类、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，造成细胞坏死或突变。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。本实验结果表明，海带多糖对·oh 有清除作用，且其清除率随海带多糖的剂量的增加而增大，呈一定的量效关系(表1)。表1 海带多糖对·oh 的清除作用
2.2 海带多糖对o-2的清除作用
o-2 是活性氧的一种，在体内由过氧化物歧化酶清除，如果体内过氧化物歧化酶活力下降或o-2产生过量都会给机体造成危害。本实验结果显示，海带多糖对 o-2的清除作用与海带多糖的剂量呈一定的量效关系，当海带多糖的浓度为10.00 mg/ml 时，可以显著抑制o-2的产生(表2)。表2 海带多糖对o-2的清除作用
2.3 海带多糖对小鼠红细胞溶血的影响
h2o2为强氧化剂，可以破坏红细胞膜而导致血红蛋白溢出出现溶血，本实验观察了海带多糖对h2o2诱导的红细胞氧化溶血的影响。结果显示，海带多糖对h2o2诱导的红细胞溶血具有明显的抑制效果(表3)。表3 海带多糖对红细胞氧化溶血的影响
2.4 海带多糖对小鼠心、肝及肝线粒体脂质过氧化产物生成的影响
mda为脂质过氧化产物，其生成的多少可以反映出组织细胞的受损程度，本实验测定了海带多糖对小鼠心、肝匀浆及肝线粒体中mda生成的影响。结果显示，海带多糖可以有效抑制小鼠心脏、肝脏组织匀浆及肝亚细胞脂质过氧化的发生，且mda 的抑制率随海带多糖浓度的增加而提高(表4～6)。表4 海带多糖对小鼠心mda生成的影响表5 海带多糖对小鼠肝匀浆中mda 生成的影响表6 海带多糖对小鼠肝线粒体中mda 生成的影响
3 讨 论
活性氧自由基(reactive oxygen species ，ros)包括h2o2 、·oh、o-2 等是在人体内新陈代谢的中间产物。一般来说，在人的正常新陈代谢中，ros的产生和清除保持着动态平衡[8]。当机体内的诱导物诱导氧化能力超过抗氧化物抗氧化能力时，就会引发细胞死亡并导致组织的损害。目前发现ros与人类多种疾病的发病机理相关，如癌症、衰老和动脉慢性病[9]。因此，医药领域一直在不断探索和利用抗氧化物质来清除ros来阻止氧化损害，而天然的抗氧化物质具有低毒的特点，一直是学者研究的热点。
本实验研究表明,海带多糖体外可清除o-2 及·oh，抵抗小鼠红细胞的氧化性溶血，抑制小鼠心、肝及肝线粒体中mda的生成，具有清除自由基及抗脂质过氧化的作用,是一种天然抗氧化剂。
我国海域辽阔，海带资源十分丰富，采集和养殖工艺简单。本试验对于海带多糖的研究、开发、利用提供了实验依据。
【参考文献】
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[2] 梁桂宁,谢露,胡世凤，等. 海带多糖对应激小鼠肾组织抗氧化能力的影响[j]. 现代医药卫生,2006,(18): 2783-2784.
[3] 高梦祥,叶森. 海带多糖的提取工艺研究 [j]. 长江大学学报:自然科学版,2005,2(5): 73-76.
[4] smirnoff n,cumbes q. hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes [j]. phytochemistry,1989,28 (4): 1057-1060.
[5] 王书芳,王勤,潘静. 吡咯啉氮氧自由基及衍生物抗大鼠不同组织脂质过氧化损伤 [j]. 中国药理学通报,2001,17(4): 424 - 427.
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[7] 曹炜,尉亚辉,杨建雄. 蜂胶对氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝脏损伤的保护作用 [j]. 中药材,2001,32(11): 1013-1015.
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[9] moskovitz j， yim m b， chock p b. free radicals and disease[j]. arch biochem biophys,2002,397(2),354-359.
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