第1篇：2017年春季河南信阳H7N9流感病毒监测报告
近期，我国部分省份出现人感染H7N9病例，造成人员死亡，引起社会极大关注。农业部在活禽交易市场内检测到H7N9流感病毒，家禽防控形势比较严峻。为有效防范风险，进一步做好H7N9防控工作，信阳市开展了H7N9流感病毒的血清学和病原学监测，现报告如下：
1材料与方法
1.1样品采集2017年2月7日～3月13日，在信阳市平桥区、浉河区、淮滨县、潢川县、新县、光山县、息县、商城县和罗山县等9县区的禽场、活禽交易市场及屠宰场155个，共采集血液样品3016份、喉头泄殖腔双拭子样品410份（运输保存使用2ml离心管，加装1.2ml含有双抗、10%甘油的PBS液体）、环境水样5份。所有样品2～8℃条件下送达实验室，-20℃保存备用。
1.2检测试剂与仪器检测试剂：禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原（H7N9株）与阴、阳性血清（批号：）购自哈尔滨维科生物技术开发公司；人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）（批号：P20160410）购自上海之江生物科技股份有限公司；1%鸡红细胞悬液，采集3只未免疫禽流感和新城疫的健康公鸡自行配制。
仪器：LC-800低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），Eppendorf10～1000μl单道移液器及25～300μl多道移液器（德国Eppendorf公司），96孔V型（90°）微量反应板。
1.3检测方法及判定标准禽流感病毒H7亚型（H7N9株）抗体检测和H7N9流感病毒核酸检测参照试剂说明书的内容进行。禽流感病毒血凝试验抗体检测方法判定标准：以完全抑制4单位抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI效价。当阳性对照血清的HI效价与已知效价误差不超过1个滴度，阴性对照血清的HI效价不高于2log2时，试验方可成立。被检血清HI效价≤3log2判为阴性；=4log2判为可疑（可疑样品应重检，重检效价≥4log2判为阳性，≤3log2判为阴性）；≥5log2判为阳性。
人感染H7N9流感病毒核酸检测试验结果的判定：Ct值≥45，判为阴性；432监测结果
2.1H7N9总體检测情况本次血清学共检测各县区155个场点的样品3016份，阳性0份，具体分布见表1；病原学监测415份，未检出阳性，具体检测情况见表2。
2.2不同场点类型检测情况见表3、表4。
3讨论与分析
3.1信阳市共辖7县2区，本次检测9个县区155个场点，包括鸡场、鸭场、活禽交易市场、屠宰场等不同场点，基本能够反映我市H7N9感染状况。本次调查，信阳市未发现H7N9流感血清学和病原学阳性。鉴于全国及河南省不断发展的疫情形势，信阳市还是要加强H7N9的监测与防控，防患于未然。
3.2为切实做好H7N9流感防控工作，努力确保信阳市养禽业的生产安全和公共卫生安全，需采取综合性防控措施：
一是切实加强部门协作。各县区畜牧兽医部门要继续加强与卫生、食药、工商等部门的协调配合，建立联防联控机制，加强部门会商，及时研判防控形势，加强协调配合，强化信息沟通和措施联动，形成防控的合力，共同做好动物H7N9流感防控工作；二是加强紧急排查和监测。县区畜牧兽医部门要全面加强H7N9监测工作，根据省市监测方案要求，明确分工、各司其职，落实好疫情排查和监测工作，加强流行病学调查，全面掌握当地H7N9流感病毒的三间分布，发现异常情况要及时上报并按相关规定处置，尤其对临床发现疑似症状死亡的禽类，要及时报告。在家禽或环境样本中监测到病原学阳性的，要及时开展紧急监测和流行病学调查，并按相关文件要求采取相应措施，坚决进行补杀和无害化处理，消除污染源。要切实加强养殖场户综合防疫管理，加强对活禽及其产品运输工具、笼具、人员的消毒灭源，提高生物安全水平。要严格执行疫情报告和举报核查制度，认真履行疫情报告职责，发现问题及时报告；三是加强活禽市场防控措施落实。县区畜牧兽医部门要按照职责分工，积极配合卫生计生、食药、工商等部门加强活禽市场监管，努力降低病毒在活禽市场向人传播的风险，努力降低病毒由活禽市场向养殖场传播的风险。要督促活禽市场落实休市、清洗、消毒等措施，推动建立活禽市场一日一清洗、一周一消毒、一月一休市、过夜零存栏制度（即1110制度）。对关闭活禽交易市场后出现的流动摊点私自宰杀活禽、违法经营和交易的现象，要及时报请政府采取措施，查处整治；四是加强监督检查。动物卫生监督机构要加强对禽类养殖场、禽类屠宰厂、活禽交易市场等重点场所的监督检查，查验有关场所是否具备国务院兽医主管部门规定的动物防疫条件、家禽出栏或屠宰前是否申报检疫、上市家禽是否持有动物检疫合格证明、病死畜禽是否进行了无害化处理等。要依法严厉打击逃避检疫、经营和运输染疫家禽及其产品、病死或者死因不明禽类的违法行为，发现案件线索，坚决做到一查到底，决不放过，情节严重的，要移交公安机关立案查处；五是强化应急管理。各地要加强组织领导，按照《重大动物疫情应急条例》、《国家突发重大动物疫情应急预案》等相关要求，健全完善应急机制，加强应急值守，规范应急程序，充实应急物资储备。要认真安排好应急值守，严格执行24h专人值班和领导带班制度，确保信息畅通；六是做好人员自身防护。加强对防疫、监测、检疫等人员以及从事禽类养殖、运输、屠宰、销售等密切接触人员的宣传和指导，普及禽流感防控常识，正确采取防护措施，加强从业人员职业防护教育；七是加强正面宣传和舆论引导。H7N9可防可控。各地要坚持适度宣传、科学发布的原则，及时、全面地发布H7N9防控信息，加强在主流媒体的正面宣传，普及H7N9防控和禽类产品消费知识，引导公众科学消费，理性对待H7N9。各地要积极协调新闻宣传等部门，采取措施防止媒体过度炒作，防止再度出现“谈禽色变”，避免引发恐慌，殃及家禽业发展。
作者：徐华
第2篇：基于网络的流感病毒复制的研究
1引言
人类约60-70%的传染性疾病是由病毒感染所引起。近年来，重大病毒传染性疾病的爆发流行日趋严重，对人类健康和社会经济发展构成了巨大威胁。而这些病毒必须依靠宿主细胞才能不断的复制下去，基于网络的系统生物学方法，揭示病毒复制及与宿主相互作用网络的分子机制，发现抗病毒药物新靶标，为病毒性传染病预防和治疗提供新理论和新技术，是当前生命科学研究的前沿领域之一[1]。
2多层网络的构造
2.1数据来源
在美国国家生物信息中心已经公开的数据库中，GEO号为GSE49840的数据库中包含了四组基因表达谱数据。这四组数据分别是被新型禽源流感病毒H7N9，禽流感病毒H5N1和H7N7，以及H3N2流感病毒数据。该实验数据通过四种不同的病毒去感染样本，并且分别测量了病毒感染后宿主在3小时、7小时、12小时和24小时的基因表达谱数据。
2.2数据预处理
对于每一组基因表达谱数据，我们根据探针信息的注释文件，将探针号与基因ID号对应起来，如果没有对应的基因ID号，我们将舍弃该探针，如果有几个探针对应的是同一个基因的ID号，我们将这几个探针的平均值作为该基因的表达谱数据。
2.3基因的选取
自2008年以来共有六个科研小组发现了参与流感病毒复制的人体宿主细胞因子，在这些宿主因子中有128个宿主基因至少被两个实验证明参与了流感病毒复制[2]。我们发现这128个基因中有116个基因在GSE49840数据库中有基因表达谱数据值，所以我们以这116个基因作为我们研究工作的候选基因。
2.4多层网络的构建
一共有四组基因表达谱数据，所以我们构建了一个四层的多层网络，每一层是一种流感病毒的复制调控网络，用一个线性方程来近似基因间的调控关系，用偏最小二乘法求解线性模型中的调控参数，并进一步利用阈值筛选有显著意义的调控关系，具体的步骤如下：
（1）计算成对基因之间的皮尔逊相关系数，设定阈值，得到一个流感病毒复制调控的初始网络；
（2）为了简化，用一个线性方程来描述病毒复制有关的基因之间的调控关系：
其中表示第个基因的表达水平，表示第个基因对第个基因的作用强度。
（3）在Matlab中调用spline函数，根据基因在3小时、7小时、12小时、24小时的表达值，利用三次样条插值每隔0.5小时进行插值，然后用中心差分值代替微分值，得到基因在3小时、7小时、12小时、24小时这四个时刻的表达值变化率：
（f）选取合适的阈值，删除相互作用强度较小的边，从而得到每种病毒感染下的基因调控网络。阈值的选取是基于统计网络的节点数随着的变化情况，当节点数发生显著变化时此时对应的值即为阈值。
3重要模块及基因的识别
首先基于所构造的多层网络，利用模块探测算法ClusterOne[4]，识别了每一层网络中的模块。然后参照文献[5]中定义的模块影响力指标，分别计算了四层网络中每一层网络的高影响力模块，如表1所示：
在这些高影响力模块中，基因DAP3、C6orf62、ACVR1C、ATP6V0D1至少两次出现在了不同病毒的高影响力模块中，我们认为这四个基因在流感病毒的复制过程中发挥了重要的作用。它们可以成为新的抗病毒药物的靶标。
4结论
本文中基因表达谱数据出发，利用偏最小二乘法构建了一个流感病毒复制的基因调控多层网络，每一层网络是一种流感病毒，然后基于所构造的多层网络挖掘了与病毒复制有关的重要模块和基因为流感病毒复制机制的研究和抗病毒药物的研制提供了新的思路。
作者：崔双龙等
第3篇：我国野禽流感病毒研究现状及其发展趋势
自流感病毒被首次发现已有100多年，人类投入大量的精力致力于流感病毒和禽流感的研究，但迄今为止仍未掌握流感病毒的特异性预防和治疗方法。随着流感病毒的进化，它不仅在家禽与野禽间传播，而且可以跨越种属，感染马、猪、海豹、鲸、水貂等动物，乃至人类。近年来，流感疫情频繁暴发，逐渐呈现出跨地区、跨季节、人禽交叉感染等特点，自2013年以来WHO共接到人感染H5N1病例191例，感染H5N6病例3例，H7N9病例662例，其中我国659例[1]，然而这只是人感染流感病毒病例的一部分。目前流感病毒已对人类产生严重威胁[2]，因此，对流感病毒的相关研究一直是医学领域中的热点。
研究表明，野禽是流感病毒的天然宿主和储存库，且几乎所有亚型的流感病毒都已在野禽体内检测到[3-5]。野禽活动范围大，种类众多，感染的流感病毒类型也多，并且存在采样难度大等问题，因此关于野禽流感方面的研究深度与进度相对滞后。笔者对野禽流感病毒的研究现状及今后的发展趋势进行综述，以期为野禽流感病毒的研究及保护区的疫病防控提供参考。
1流感病毒及其分型
流感病毒属于正黏病毒科，包括5个属，分别为A型流感病毒属（InfluenzavirusA）、B型流感病毒属（InfluenzavirusB）、C型流感病毒属（InfluenzavirusC）、托高土病毒属（Thogotovirus）和鲑传贫病毒属（Infctioussalmonanemiavirus）[6]。其中，A型和B型流感病毒结构类似，而C型流感病毒则有很大不同；A型流感病毒感染的宿主范围最广，包括人、猪、马、禽类等，是人和动物呼吸道疾病的重要病原；B型流感病毒主要感染人，常常局部暴发，不会引起世界性流行；C型流感病毒主要以散在形式出现，侵袭婴幼儿，一般不会引起流行[7]。在A、B、C3个流感病毒属中，只有A型流感病毒具有引起动物严重感染、宿主转换和暴发大流行的能力。根据其表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性不同，可将A型流感病毒分为18个HA亚型和11个NA亚型，目前人们熟知的有16种HA亚型和9种NA亚型，均是从水禽中分离到的[8-9]，其中H1、H3、H5、H7、H9亚型的危害最为严重，是目前流感检测和监测的重点。
A型流感病毒是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，其基因组由7～8个节段组成，总长13.6kb，共编码14～15种蛋白，包括HA、NA、PB1、PB1-F2、PB2、PA、PA-X、PA-N155、PA-N182、NP、NS（NS1/NS2）、M（M1/M2），这些蛋白之间相互作用，单独或共同决定病毒的毒力和致病性。节段1～3编码聚合酶（PB2、PB1、PA）和毒力因子（PB1-F2），节段4编码血凝素（HA），节段5编码核蛋白（NP），节段6编码神经氨酸酶（NA），节段7编码基质蛋白（M1、M2），节段8编码非结构蛋白（NS1、NS2），其中PB1、PB2和PA高度保守，NP和M蛋白是主要的结构蛋白，是病毒划分类型的主要依据，是流感病毒的通用检测及流感病毒型特异性诊断的理想靶标，HA和NA极易突变[10]，不同亚型或同一亚型不同毒株间序列均存在明显差异，是流感病毒亚型的划分依据之一[11]，也是病毒遗传演化分析中常用的靶基因及检测特异性抗体的理想靶标[12]。
2流感病毒的传播方式
学者们认为所有流感病毒的共同祖先都来源于水禽，禽流感病毒的谱系也证实流感病毒与水禽的世界迁徙路径吻合，并且一直在遵循各自变异趋势在不断进化。由于流感病毒能够在呼吸道、消化道和生殖道中复制，因此病毒能够经多种途径传染。病毒能够从受感染禽类的鼻腔、口腔、结膜和泄殖腔排放到环境中，通过直接接触或气溶胶形式进行水平传播，也可以通过飞沫或接触呼吸道分泌物和泄殖腔排泄物发生感染，总之主要经过呼吸道传播，如密切接触被感染的禽类及其分泌物、排泄物，被受病毒污染的水源、食物以及直接接触病毒毒株被感染。当流感病毒感染易感动物后，可在易感动物的呼吸道和消化道进行复制和增殖，可通过呼吸道和泄殖腔长时间向外排毒，导致生境或水源污染，并通过被污染的生境或水源经粪便-水-口腔途径或口-水-口的途径传播[13]。流感病毒在同种宿主的个体之间传播最容易，也最频繁，但也能在亲缘关系较近的物种之间发生种间传播，甚至对人类健康构成潜在的威胁[14]。
3禽流感及其流行现状
禽流感是由A型流感病毒引起的禽类（野禽和家禽）的一种从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病。根据病原的致病特性，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。高致病性禽流感（HPAI）是由高致病性禽流感病毒引起的一种具有高度传染性和高死亡率的严重危害野禽和家禽的疫病。世界各国对高致病性禽流感高度重视，OIE将其列为必须申报的动物疫病，我国将其列为一类动物疾病[15]。在野禽中，禽流感的宿主范围广泛，包括野鸭、野鹅、燕鸥、剪尾鸥、海鸥，甚至南极的企鹅也有感染AIV的血清学证据[16]。流感病毒的流行有一定的季节性，往往在野禽迁徙的过程中高发，随着迁徙直接造成流感病毒的远距离传播，带毒鸟类经常通过排泄粪便等方式将病毒释放到水体和土壤环境中[17-18]，从而使其他野禽或者家禽通过粪口途径感染，导致病毒的持续性传播，增加了病毒潜在重组的可能[19]。因此，野禽携带的流感病毒带来的威胁不容忽视[20]。
4野禽对流感病毒的适应
1961年从野生鸟类体内分离到流感病毒，然而直到20世纪70年代中期学者们才真正开始对野禽的流感病毒的系统研究。研究表明，野禽体内存在大量的遗传性和抗原性多样化的流感病毒，而且感染后大多数并不表现出症状，称之为“低致病性流感病毒”，这种情况多见于雁形目水禽（如野鸭、天鹅等）以及鸻形目的鸥类。目前已在100多种野禽体内发现流感病毒，并通过呼吸系统和排泄系统传播病毒，只是没有表现出明显的症状[21]，但能持续排毒，随着季节性迁徙而污染水源和栖息地，这种病毒隐性污染的水源成为野禽与家禽之间感染的重要病毒来源[22]。HA和NA亚型在野禽中分布并不均匀，一般雁形目野禽能被多种亚型的流感病毒感染，而鸻形目野禽主要感染的是H3和H16，其他目的野禽也能分离到多种流感病毒，但研究主要集中在雁形目的水禽和鸻形目的滨鸟。由于流感病毒宿主的多样性，导致流感病毒在自然界中长期存在，而且更多的流感病毒亚型可跨越种属间的障碍而相互传播，并在传播过程中不断发生基因重组，最终产生新型的流感病毒[23-24]。在进化压力和自然选择的作用下，新型流感病毒的传播力和致病力越来越强，如果从野禽传播到家禽则有可能导致高致病性禽流感的暴发，因此，对流感病毒的监测、防控与治疗越来越难，这也是今后流感病毒研究的重要方向。
5我国野禽禽流感研究中存在的问题
我国禽流感病毒检测技术研发水平已经实现了与国际同步，既有传统的病毒分离、HA-HI试验等技术方法，也有RT-PCR、荧光RT-PCR、基因芯片等分子生物学方法，不但借鉴了西方发达国家的研究经验，也根据我国的国情进行了研究和改进，在禽流感病毒的监测与防控方面发挥了积极的作用。由于野禽种类众多，活动范围太大，携带的大多是低致病性流感病毒，因而一直没有得到人们的高度重视，但近几年多例野禽感染家禽，甚至能够在哺乳动物体内进行有效复制，具有感染哺乳动物的致病能力，使人们开始认识到野禽在流感病毒传播过程中所扮演的角色。尽管如此，由于野禽感染病毒的类型多，且存在采样难度大、不易监控等问题，导致野禽流感病毒的相关研究明显落后于家禽。
虽然对野禽流感病毒的研究逐渐深入，但是对流感病毒的防治尚无特别有效的方法，各国对流感病毒的防控策略不尽相同，都是将监测和快速诊断、治疗作为首要步骤。因此，鉴于野禽携带的流感病毒对家禽和人类公共卫生的威胁，关于我国野禽流感病毒的防控，应该是在加强流感病毒研究的同时，积极开展普查和监测，尽早发现、尽快处理、及时防控，防治流感病毒在野禽与家禽之间反复循环感染与变异，从而建立一个良好的生物安全体系，有效防控流感病毒。
作者：齐艳萍
第4篇：银花平感颗粒体内抗甲型H1N1流感病毒作用
流感是一种由流感病毒引起的严重威胁着人类的呼吸道传染病，具有发病率高、流行广泛、传播迅速等特点[1]。流感病毒属于正粘科病毒，主要由甲型和乙型流感病毒引起，甲型流感病毒表面抗原HA和NA较易发生变异，甲型流感病毒又可分为15个HA亚型（H1～H15）和9个NA亚型（N1～N9），是引起流感流行最重要的病原体[2]。甲型流感病毒中H1N1型和H3N2型流感较为广泛，可造成大流行，由于流感病毒抗原性容易变异，新病毒株不断形成，现有的药物已很难满足临床需求。相比化学药，中药在防治流感方面表现出了独特的优势，具有副作用小和不易产生耐药性等优点，还能通过调节机体免疫功能而发挥抗病毒的作用[3]，筛选并开发抗流感病毒的中药研究工作有着广阔的前景。
银花平感颗粒（原名金平感颗粒）是由《伤寒论》麻黄汤等方药加减组成，主要由金银花、麻黄、杏仁、虎杖、甘草等组成，具有清热解毒，宣肺解表等功效，已获国家中药新药银花平感颗粒的国家发明专利（专利号ZL031511880）和中药新药证书（国药证字Z20120004）。前期研究表明银花平感颗粒具有抗炎、镇咳的作用[45]，而鸡胚实验显示银花平感颗粒对流感病毒有很好的抑制作用[6]。本研究基于前期研究成果，观察银花平感颗粒对流感病毒感染小鼠肺指数、肺部病理改变和肺组织病毒载量的影响，研究其体内抗甲型H1N1流感病毒作用；采用流式细胞仪检测外周血T细胞亚群（CD4+，CD8+，CD4+/CD8+）变化，探讨银花平感颗粒对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响，为该药的临床应用提供理论和实践依据。
1材料
1.1药物与试剂银花平感颗粒（杭州华东医药集团康润制药有限公司，批号001106）；利巴韦林颗粒（四川百利药业有限责任公司，批号131165）；肝素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号20131016）；RNeasyMineKit试剂盒（德国QIAGEN公司，批号74104）；PrimeScriptTMRTMasterMix（批号AK3101），SYBRPremixExTaqTMⅡ试剂盒（批号AK5805）均购自TaKaRa公司；PEAntiMouseCD8a（批号3276860），FITCHamsterAntiMouseCD3e（批号3212522），PECyTM5RatAntiMouseCD4（批号3228507）均购自美国BD公司。
1.2动物ICR小鼠，SPF级，18～22g，雄性，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK（沪）20080016。
1.3病毒甲型流感病毒小鼠肺适应株（A/PR8/34，浙江省疾病预防与控制中心提供），鸡胚传代后，测定病毒效价1∶1024。
1.4仪器BDFACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；MICROMHM340E石蜡切片机（德国MICROM公司）；BX60型荧光显微镜摄像机（日本OLYMPUS公司）；DHG9140A型电热恒温干燥箱（中国上海精宏医疗设备有限公司）；LeicaHI120型摊片机（德国Leica公司）；ABIQuanStudio12KFlex实时荧光定量RTPCR仪（美国LifeTechnologies）；NanoVue超微量分光光度计（美国GEHealthcare公司）；FormaClassⅡ，A2生物安全柜（美国Thermo公司）。
2方法
2.1甲型流感病毒半数致死量（LD50）的测定将经鸡胚传代的甲型H1N1A/PR/8/34流感病毒液稀释为原液，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5的病毒液，每个稀释度10只小鼠。每只小鼠鼻孔内均匀滴入20μL病毒液，感染小鼠。观察2周后，计算小鼠LD50。结果以ReedMuench法测定其半数致死量（LD50）为1×10-35。
2.2造模与给药ICR小鼠随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，阳性对照组（利巴韦林，75mg·kg-1），银花平感颗粒低、中、高剂量组（75，15，30g·kg-1，按体表面积计算为60kg体重成人临床等效剂量的10倍）；时间点分别为感染后第3，7天，共2个时间点，每组6只。除正常组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以10LD50流感病毒PR8病毒液滴鼻感染小鼠（20μL/只）。各组与攻毒后2h灌胃给药，按002mL·g-1，每天灌胃1次，直至实验结束。正常对照组与模型对照组每天给予等剂量的生理盐水。
2.3银花平感颗粒对甲型流感病毒感染小鼠肺指数的影响各组小鼠于感染后第3天和第7天分别称取6只小鼠体重，摘眼球放血处死小鼠，以肝素抗凝。取肺组织，以生理盐水洗净，滤纸吸干表面水分，称肺重，计算肺指数与肺指数抑制率，并将肺组织保存于-80℃冰箱中用于后续实验。
肺指数=肺质量/体质量
肺指数抑制率=（模型对照组平均肺指数-药物组平均肺指数）/模型对照组平均肺指数
2.4银花平感颗粒对甲型流感病毒感染小鼠肺部病理变化的影响各组小鼠于感染后第3天和第7天分别称取6只小鼠体重，摘眼球放血处死小鼠，取肺组织，以生理盐水洗净，立即投入10%中性福尔马林溶液中固定，乙醇脱水，二甲苯透化，石蜡包埋，常规切片，HE染色，在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织病变情况。
2.5荧光定量PCR检测肺组织病毒载量引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。针对PR8株流感病毒mRNA上的M1基因片段（117bp）的上、下游引物分别是：5′TCATTGGGATCTTGCACTTG3′和5′ACTTTGGCACTCCTTCCGTA3′；内参基因GAPDH（141bp）的上、下游引物分别是：5′GCAAGTTCAACGGCACAG3′和5′CGCCAGTAGACTCCACGAC3′。
使用QIAGEN试剂盒提取肺组织RNA后，NanoVue超微量分光光度计测定RNA浓度与纯度（A260/A280），用RT试剂盒进行逆转录，逆转录反应体系（10μL）含5×PrimeScriptRTMasterMix2μL，定量至30mg·L-1。反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃10min。用上述流感病毒引物和GAPDH引物进行实时荧光定量PCR反应，反应体系20μL，反应体系含样本cDNA1μL，SYBRPremixExTaqTMⅡ10μL，10μmol·L-1引物各08μL。反应条件：95℃2min，95℃15s，55℃35s，共40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。仪器分析得出各个样品量Ct值，使用相对定量ΔΔCt方法，以GAPDH作为内对照，用2-ΔΔCt公式计算相对表达量。
2.6流式细胞仪检测外周血T细胞亚群的变化造模与给药方法同22项下方法，各组小鼠于感染后第3天和第7天分别摘眼球取血，以肝素抗凝。取全血样本50μL，分别加入CD3+，CD4+，CD8+抗体2，5，5μL，混匀，室温下避光静置反应15min。然后加入裂解液1mL，充分混匀，静置避光10min后以1500r·min-1离心5min，弃除上清液。加1mLPBS洗涤，1500r·min-1离心5min，弃除上清液。再加500μLPBS混匀，流式细胞仪检测，用CELLQuest软件分析。
2.7统计学处理采用SPSS190软件进行统计分析处理，数据均以±s表示，计量资料的组间显著性比较采用单因素方差分析（OnewayANOVA）。
3结果
3.1银花平感颗粒对甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺指数的影响流感病毒感染第3天，与正常组比较，模型组小鼠肺指数显著升高（P<001）；与模型组比较，银花平感颗粒高、中、低剂量组均能显著降低小鼠肺指数（P<005，P<001），肺指数抑制率分别为326%，236%，132%。感染第7天，与正常组比较，模型组小鼠肺指数继续显著升高（P<001）；与模型组比较，银花平感颗粒高、中、低3个剂量组的小鼠肺指数均有一定程度的降低，其中高、中剂量组差异显著（P<001），肺指数抑制率分别为394%，206%，见表1。
3.2银花平感颗粒对甲型流感病毒感染小鼠肺部病理变化的影响光学显微镜下观察各组小鼠肺组织病理切片结果见图1，正常组第3天和第7天小鼠肺泡大小完整，肺泡壁薄，细支气管及小血管壁周围组织炎症细胞浸润不明显，细支气管黏膜完整无缺，肺泡中隔未见血管扩张，充血，未见炎症细胞浸润。模型对照组第3天和第7天可见弥漫性肺泡壁增厚，肺间质内血管扩张，大量炎症细胞浸润；细支气管、小血管壁周围组织可见大量单核细胞、淋巴细胞浸润，部分见细支气管黏膜脱落坏死，且第7天较第3天严重。与模型组比较，阳性对照组肺部病变明显减轻，肺泡间隔略有增厚，肺泡大小较完整，部分细支气管壁和肺泡壁间有少量炎性细胞浸润；银花平感颗粒高、中剂量组小鼠肺部炎症均有减轻症状，肺细支气管及小血管壁周围可见少量单核细胞、淋巴细胞浸润，支气管黏膜正常，肺间质充血，并有少量炎症细胞浸润，其中高剂量组病变明显减轻；银花平感颗粒低剂量组肺间质、细支气管及小血管壁间质组织可见较多单核细胞、淋巴细胞浸润，肺泡壁增厚，间质内血管有扩张，有较多炎症细胞浸润，肺部病变无明显改善。
3.3荧光定量PCR各基因PCR扩增产物的鉴定各基因PCR扩增曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象，指数期明显。流感病毒（PR8）mRNA的M1基因溶解曲线在80℃左右处形成单一的荧光峰，GAPDH在85℃左右处形成单一的荧光峰。说明荧光定量PCR产物具有特异性，无引物二聚体产生。流感病毒（PR8）mRNA的M1基因和GAPDH荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳产物均为单一条带，见图2，说明病毒引物基因和GAPDH引物参与的PCR扩增是成功的。
3.4银花平感颗粒对甲型流感病毒感染小鼠肺组织病毒载量的影响正常组小鼠肺组织内无病毒载量表达；甲型流感病毒感染小鼠后，模型对照组第3天和第7天小鼠肺组织病毒载量均明显高表达，且第7天病毒载量比第3天病毒载量高。感染第3天，银花平感颗粒高、中剂量组病毒载量显著低于模型对照组（P<001），低剂量组无显著差异；感染第7天，银花平感颗粒高剂量组病毒载量差异极显著（P<001），中剂量组差异显著（P<005），见表2。
3.5银花平感颗粒对流感病毒感染小鼠外周血T细胞亚群的影响与正常组比较，流感病毒感染第3天和第7天模型组小鼠外周血内CD8+T细胞数量上升，CD4+T细胞数量以及CD4+/CD8+比值降低（P<001）。与模型组比较，银花平感颗粒能够抑制流感病毒感染小鼠外周血CD8+T细胞数量上升以及CD4+T细胞数量下降。感染第3天，银花平感颗粒高、中剂量显著提高CD4+T细胞数量、降低CD8+T细胞数量（P<005，P<001）；且银花平感颗粒各剂量组均能显著提高CD4+/CD8+比值（P<005，P<001）。感染第7天，银花平感颗粒高、中剂量显著提高CD4+T细胞数量和CD4+/CD8+比值，降低CD8+T细胞数量（P<005，P<001），见表3。
4讨论
流感病毒感染机体后，常引起机体免疫功能的改变，导致气道和肺部的损伤以及细支气管炎和肺炎的发生[78]。小鼠感染流感引起肺炎，导致肺组织内炎症细胞渗出增多，形成肺实变，使肺质量增加。有研究表明，流感病毒感染主要导致免疫病理损伤，而不是病毒直接介导的呼吸道上皮损伤[910]。中药抗流感病毒的作用机制研究主要表现在：抑制病毒复制以及直接杀病毒作用[1112]；抑制流感病毒引起的肺组织炎症[1314]；调节机体细胞免疫功能[1516]；对氧自由基的清除作用[17]；抑制流感病毒引起的组织细胞凋亡[18]等。本实验显示，银花平感颗粒能显著降低流感病毒感染小鼠肺部组织病毒载量，说明银花平感颗粒对体内流感病毒的复制具有显著地抑制作用。感染病毒第3天和第7天，肺指数和肺部病理变化检测结果表明银花平感颗粒能够显著降低流感病毒感染小鼠肺指数，减轻流感病毒感染引起的小鼠肺部病变，说明银花平感颗粒具有很好地抑制流感病毒引起的肺组织炎症作用。T淋巴细胞亚群变化可以反映机体的免疫状态，CD4+/CD8+是评估机体免疫状态的指标。有研究表明，流感病毒感染小鼠后能引起CD4+T细胞数量下降以及CD4+/CD8+降低[19]。本研究发现感染流感病毒第3天和第7天模型组小鼠CD4+T细胞数量以及CD4+/CD8+显著低于正常组，而CD8+T细胞数量高于正常组，说明流感病毒感染后引起小鼠免疫功能下降。银花平感颗粒能够有效地抑制流感病毒感染小鼠外周血CD8+T细胞数量上升以及CD4+T细胞数量下降，提高CD4+/CD8+，表明银花平感颗粒通过调整免疫功能的失衡来发挥抗病毒作用。
本实验考察了银花平感颗粒体内抗甲型流感病毒的作用，探讨了其对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响。结果表明银花平感颗粒通过抑制流感病毒复制、减轻流感病毒感染小鼠肺部损伤以及改善免疫功能来发挥抗病毒效应，对H1N1流感病毒感染的小鼠有一定的治疗作用。本实验研究结果为银花平感颗粒在临床用于防治流感病毒性肺炎提供理论和实践依据。
作者：彭学谦
第5篇：分子技术在流感病毒诊断中的应用
流行性感冒病毒（influenzavirus）属于是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒。人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。分子技术应用于流感病毒的诊断对分子生物学以及医学研究和社会发展具有重要意义。
1定性PCR扩增：逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）的科学原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。将逆转录-聚合酶链反应用来鉴别当前的流感病毒的型别，使用的扩增片段一般应该具有高度保守序列的核蛋白以及M蛋白；如果用逆转录-聚合酶链反应来鉴定一种流感病毒的亚型，那么就应该针对编码表面的抗原基因具有的保守序列去设计引物。
根据目前相关生物研究所对HA的研究，各中流感亚型病毒HA蛋白裂解位点的氨基酸是不同的，HA即是血凝素，红血球凝聚素。在流感的病毒的表面存在两种蛋白质，一种称为红血球凝聚素（hemagglutinin），另一种为神经氨酸酶（neuraminidase）。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“N”指代后者。而就目前而言，红血球凝聚素有16（H1～H16）种形态，神经氨酸酶则有9（N1～N9）种形态。血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，后者可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，前者则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合。血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色。
2实时荧光定量RT-PCR
实时PCR（realtime-PCR）。实时PCR也就是指利用荧光信号累积进行实时监测整个PCR的进程，然后以标准曲线或者公式法来定性和定量对流感病毒中的RNA模板进行分析。对实时技术来说，它指的是在同管内去进行扩增以及检测，这也是是分生物分子技术诊断方法进步的标志，对于这种定量所使用荧光色素来说，目前研究以及医学临床的所用的荧光探针还是较多的，主要是由以下的多种构成：荧光共振能量转移（FRET）杂交双探针、YBRgreen荧光染料法以及Taqman水解探针（cleavage-basedprobes）等等，其中Taqman水解探针一般是用于检测H1N1流感病毒，它的敏感性高达110copy/mL。
荧光定量PCR技术。荧光定量PCR技术是基于PCR技术基础之上的。这种技术具有能够对DNA的高效扩增、以及探针技术的高特异性，光谱技术的高度敏感性以及定量等等的优点，实时荧光定量RT-PCR主要拥有以下的优势：快速，以及能够对反应体系的PCR产物进行实时的监控，也就是当PCR结束之时即获得了检测的结果，整个过程只需要维持2h；经济，这种技术在病毒检测中应用能够节省电泳以及染色，避免反应体系的产物被污染；灵敏度高，由于实时荧光定量RT-PCR采用了特异性的荧光探针以及高灵敏度的CCD技术，使检测相比传统的PCR方法在灵敏度方面高达100～1000倍并提高了检测的准确性。
3测序法
在逆转录-聚合酶链反应过程中，当RT-PCR和实时RT-PCR不能获得流感病毒的基因序列信息以及在反应过程中检测出流感病毒的型别却不能分型的时候，可以采取对RT-PCR的反应体系的产物进行测序，和对流感病毒进行鉴定以及流感病毒的亚型判断还有它的致病性分析。这也就是说当没有具体的流感病毒的检测方法，我们可以将测序作为对病毒检测的临时检测方法。测序法的另外一个好处就是，如果有新流感亚型病毒出现的时候，这种测序的检测方法不仅能够检测出这种新的病毒亚型，而且还能够作为其他检测方法的验证实验。
4基因芯片
基因芯片，它的技术原理和经典核基因芯片到底技术原理是一样的，具体到流感病毒的检测中也就是针对流感病毒的基因组序列的保守区域，进行特异性检测探针的设计，同时制备流感病毒的检测芯片，进而对流感病毒的病毒靶序列使用限制性的显示技术进行标记，最后将这种标记的产物与基因芯片进行杂交清洗以及扫描，之后对结果进行科学的分析。总的来说，这种方法对流感病毒以及其亚型的早期检测是极其有效的，具有高敏感性以及高通量和高灵敏度，检测的准确性也极高。
总而言之，由于时代的不断向前的发展以及生物科学技术的提高，生物分子技术应用于医院临床研究也开始成为的生物分子科学发展的必然趋势。就前文所述的生物分子技术，多重荧光RT-PCR，由于它本身具有快速、灵敏以及特异的优点，能够迅速快捷准确的得出检测的结果，可以将它应用于流感病毒的快速诊断中，不仅如此，由于流感病毒的变异性极强，因此应用生物分子技术对它检测而具有其他检测技术没有的优势-能够迅速的判断出病毒的种类。随着生物分子技术的不断进步，这使得流感病毒的快速确证性诊断已经成为可能发生的事实，有其是在流感大暴发时期，这种技术的应用能够快速的控制流感病毒的蔓延，生物分子，所以，对分子技术在流感病毒诊断中的应用分析是有其必要性的，这对医学以及生物分子学还有社会的稳定和谐来说，都具有积极的意义[1-5]。
作者：吴利军等
第6篇：国产流感病毒裂解疫苗的免疫原性及安全性分析
流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，流感可造成流感病毒在人群中的快速传播与流行[1]，流感疫苗接种可降低流感发病率及病死率，因此近年来流感疫苗接种人数呈现上升趋势。目前市场上的流感疫苗品种繁多，如何选择安全有效的流感疫苗是保证接种成功与否的关键。本文将进一步比较国产流感病毒裂解疫苗及进口流感病毒裂解疫苗的免疫原性及安全性，现报道如下：
1资料与方法
1.1一般资料选择104例于2010年3月～2014年6月在我院接受流感病毒裂解疫苗接种者，所有研究对象均无过敏史、先天性、遗传性和免疫缺陷疾及精神病病史，且无流感病毒疫苗接种史，排除妊娠期及哺乳期人群。将接种者分为国产疫苗接种组（观察组）和进口疫苗接种组（对照组），每组各52例。观察组人群男性28例，女性24例，平均年龄（34.2±2.6）岁，对照组人群男性29例，女性23例，平均年龄（32.6±2.9）岁，两组人群在一般资料方面的差异未见明显差别（P>0.05）。
1.2疫苗接种观察组人群选用浙江天元生物药业有限公司生产的流感病毒裂解疫苗接种，对照组人群选用葛兰素史克生产进口流感疫苗，成人疫苗规格为0.5mL/支/次，儿童疫苗规格为0.25mL/支/次。接种前测体温并询问健康状况，合格者于上臂三角肌肌内接种疫苗，6个月～35个月（三岁以下）儿童间隔28d接种第二针。
1.3观察指标观察两组接种人群在接种4w后的H1N1、H3N2和B型HI抗体阳转率，计算抗体几何平均滴度（GMT），HI抗体<1：10者按1：5计算。同时参照1997年版《预防接种手册》[2]观察并记录两组人群的不良反应情况，其中局部反应主要包括接种部位红晕、浸润、肿胀和疼痛，全身反应主要包括头晕、头痛、乏力、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发热等症状。
1.4统计学分析采用SPSS16.0软件包，计数资料用率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1抗体阳转率见表1，两组人群在免疫接种后的H1N1、H3N2和B型抗体阳转率之间的差异未见统计学意义（P>0.05）。
2.2GMT增长倍数见表2，两组人群在GMT增长倍数方面的差异未见统计学意义（P>0.05）。
2.3不良反应见表3，两组人群在局部反应发生率和全身反应发生率方面的差异未见统计学意义（P>0.05）。
3讨论
流感具有高度的传染性，常造成不同程度的局部流行暴发，扩散发病率极高，近年来不断出现的新型流感病毒也在威胁着人类的生命安全[3]。
临床用于接种的流感疫苗主要分为国产疫苗和进口疫苗，本研究结果表明国产流感病毒裂解疫苗与进口流感病毒裂解疫苗具有相似的安全性和免疫原性，这与黄清霄[4]的报道一致。流感疫苗的免疫原性评价目前多采用欧洲医药产品评估机构（EMEA）标准[5]，本研究以此为评价标准发现，目标人群在国产疫苗免疫接种后的H1N1、H3N2、B型抗体阳转率及GMT增长倍数均在理想范围内，这表明接种后产生了较好的免疫效果。此外，本研究还发现国产疫苗免疫接种后的不良反应发生率较低，有文献[6]报道接种国产流感疫苗不良反应发生率为10%～64%，其中全身反应发生率较低，局部反应一般症状较为轻微，不影响正常活动和工作，提示该疫苗具有较好的临床安全性。
综上所述，国产流感病毒裂解疫苗具有较好的免疫原性及安全性，值得推广应用。
作者：吴建桥
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