【摘要】 亚硝基阴离子是生物体内重要的生物调控小分子，广泛分布于生物体的血液和组织中，能使蛋白质发生硝基化和亚硝基化修饰，并且调控生物体的多种生理过程。本研究应用高灵敏度的基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱（malditofms）技术，以合成的标准肽段和肌红蛋白为模型系统。研究了蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基对ｈｎｏ２反应的敏感性，并考察了反应体系和不同的反应时间对ｈｎｏ２与多肽的反应完全程度的影响。结果表明，ｈｎｏ２能与肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，形成的叠氮化中间产物不稳定，放出氮气形成碳正离子，碳正离子可进一步发生取代或消除反应。发生取代反应，水溶液中的羟基取代n末端氨基形成m+1产物，既使得产物比原肽段分子量多1 da；发生消除反应，脱掉1分子的氨，又生成m17烯烃衍生物，从而使产物比原肽段分子量少17 da。当采用1 mol/l乙酸和1 mol/l的亚硝酸钠作为反应体系时，反应5 min, 肽段的n端氨基即可完全与ｈｎｏ２反应生成羟基取代产物和烯烃衍生物。而在上述条件下，未发现赖氨酸侧链氨基与ｈｎｏ２反应，说明ｈｎｏ２主要与肽段和蛋白的n端氨基发生反应。
【关键词】 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 蛋白质 亚硝化
1 引言
亚硝酸盐被广泛用于食品防腐添加剂。越来越多的研究证据表明: ｎｏ－２广泛分布于生物体的血液和组织中，并且调控生物体的多种生理过程［1～４］。亚硝酸盐的还原产物能使蛋白质发生硝基化和亚硝基化修饰［５］。ｈｎｏ２经酶或化学试剂还原可以产生一氧化氮（no），而no在生物体内具有多种功能，其中包括修饰蛋白质的自由巯基［５，６］。另外，no可以通过亚铁血红素相关化合物的氧化产生no2自由基，这种自由基能使蛋白质的色氨酸和苏氨发生硝基化修饰［７～1１］。ｈｎｏ２与胺的化学反应已经被广泛用于区分伯、仲、叔胺。而ｈｎｏ２与伯氨基的反应则主要是通过形成不稳定的叠氮化物中间产物，进而释放氮气并形成碳正离子，最后碳正离子发生取代或消除反应形成最终的稳定产物［1２］。malin等［１３］应用氨基酸分析技术，发现亚硝酸盐能与聚赖氨酸发生反应，使赖氨酸侧链的氨基发生脱氨生成羟基正缬氨酸。muriguchi等［１４］报道蛋白质的n末端能被氧化亚氮修饰。然而，蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基对ｈｎｏ２反应的敏感程度目前还不清楚。本研究以合成的标准肽段和肌红蛋白为模型系统，首次应用高灵敏度的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术研究蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基与ｈｎｏ２反应的敏感性。并考察了不同的反应体系和不同的反应时间对ｈｎｏ２与多肽和蛋白质的反应完全程度的影响。
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
4800 proteomics analyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪(美国abi公司)，数据处理软件为date explorer(tm)software 2.0。一级质谱数据采集使用ms1kv反射模式，20 kv的加速电压，m/z 700～3500的扫描范围，激光能量的设定值为4000,每张谱图累加1500次。马心肌红蛋白胰酶酶切肽段作为标准物对仪器进行外标校正,校准至误差≤0.1 da，相对标准偏差≤10×10－6。脱盐小柱选用c18ziptip（promega 公司）。
马心肌红蛋白和α氰基4羟基肉桂酸购自美国sigma公司；标准合成肽段p1（氨基酸序列：kgawsnvlrgmggaf, 分子量：1550.1 da）和p2（氨基酸序列：iyysmnvevtdk, 分子量：1460.5 da）由赛百盛公司合成；序列级胰蛋白酶购置于 promega公司；二硫苏糖醇(dtt)购自usb公司；碘乙酰胺( iaa) 购自new jersey公司；乙腈购自 j. t. baker公司；三氟乙酸(tfa) 购自 acros公司；nano2、hcl、h3po4、(nh4)2co3、na2hpo4、nah2po4和na3po4均为国产分析纯。
2.2 实验方法
2.2.1 马心肌红蛋白酶切及赖氨酸侧链胍基化修饰 20 μg马心肌红蛋白,加0.4 μg胰蛋白酶和200 μl 50 mmol/l nh4hco3缓冲液(ph 7.5), 37 ℃孵育１２ h; 分装每管15 μl(约1.5 μg),－20 ℃冻存备用。取10 μl上述肌红蛋白胰酶酶切肽段，加20 μl 1 mol/l o甲基异脲（1 mol/l naoh 溶液溶解），37 ℃ 反应4 h, 加1 mol/l乙酸，调节ph为8左右，此时赖氨酸的侧链氨基胍基化完全[15]，脱盐后进行质谱分析。
2.2.2 ｈｎｏ２与标准肽段的反应产物的鉴定 分别取5 μl p1、p2肽段溶液（1 g/l）, 加25 μl 1 mol/l hcl, 再加10 μl 1 mol/l nano2溶液，反应1 h ，c18ziptip 脱盐后，点靶，进行malditofms分析。
2.2.3 反应时间对反应完全程度的影响 取5份5 μl p1肽段（1 g/l）, 加25 μl 1 mol/l hcl, 再加10 μl 1 mol/l nano2 溶液，反应5 min、20 min、 40 min、 1.0 h和 2.0 h后，用c18ziptip 脱盐点靶，进行malditofms 分析。以质谱峰强度（i1533＋i1551）/i1550 的比值作为考察反应完全程度的指标。
2.2.4 ｈｎｏ２浓度对反应完全程度的影响 取5 μl p1肽段溶液（1 g/l）5份, 分别加入0.01,0.03,0.1,0.3、1.0和2.0 mol/l的乙酸和nano2溶液各10 μl（终体积为25 μl），室温放置5 min 后，脱盐点靶，进行质谱分析。以质谱峰强度（i1533＋i1551）/i1550 的比值作为考察反应完全程度的指标。
3 结果与讨论
3．1 ｈｎｏ２与标准肽段的反应产物的鉴定
为了确切的考察ｈｎｏ２与蛋白质和多肽的化学反应，实验首先合成了两个标准肽段p1（氨基酸序列：kgawsnvlrgmggaf, 分子量：1550.1 da）, p2（氨基酸序列：iyysmnvevtdk, 分子量：1460.5 da）。取5 μl p1肽段（1 g/l）,按照实验方法2.2.2节进行操作。在反应过程中，发现在反应起始，即有气体产生。反应产物的一级质谱图如图1所示。在对照一级质谱图中（图1a）发现，在没有加入hno2的对照溶液中，仅能看到p1肽段的质子化离子峰，如m/z 1550.9((p1+h)+)、m/z 1572.89((p1+na)+)、m/z 1588.8((p1+k)+)，分别对应于p1肽段的加氢、加钠和加钾的离子峰。而在加入ｈｎｏ２的反应溶液体系中，有两个明显的产物的质谱峰出现，分别为m/z 1551.8（（p1_2 +h）+）和m/z 1533.8 （（p1_1 +h）+）。产物p1_1的分子量比原肽段p1的分子量少17 da，而产物p1_2的分子量比原肽段p1多1 da。根据文献［１4］，推测产物p1_1是由于ｈｎｏ２和肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，进一步发生消除反应，脱掉1分子的氨，进而生成的烯烃衍生物；产物p1_2则是ｈｎｏ２和肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，再与羟基发生取代反应生成的羟基取代n末端氨基的产物，即在肽段的n末端的氨基被羟基替换，从而导致产物的分子量比原肽段多1 da。同时实验还观察到有其它产物生成，如m/z 1569.8（（p1_3 +h）+），此产物比原肽段分子量多19 da，我们推测此产物应为ｈｎｏ２和肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，再与cl－发生取代反应生成的氯取代n末端氨基的产物，从而导致产物的分子量比原肽段多19 da。
图1 标准肽段p1与ｈｎｏ２反应的一级质谱图（略）
fig．1 ｍass spectra of reaction products of standard peptide(p1) with nitrous acid
(a) 不加ｈｎｏ２的对照组样品质谱图（the mass spectrum of control sample without nitrous acid）; (b) 加入ｈｎｏ２的反应样品质谱图（the mass spectrum of reaction products of p1 with nitrous acid）。
为了进一步验证推测是否正确，应用malditofms 的串联质谱功能，分别选择m/z 1551.8 （（p1_2 +h）+）和m/z 1533.8 （（p1_1 +h）+）作为母离子，进行串联质谱分析，以确定产物肽段的化学反应位点，结果如图2 所示。在母离子为m/z 1551.8 的二级质谱图中（图2b）所产生的连续的b 离子的质量数均比原肽段相应的b 离子增加1 da，而在母离子为m/z 1533.8 的二级质谱图中（图2c）所产生的连续的b 离子的质量数均比原肽段相应的b 离子减少17 da，从而证明ｈｎｏ２和肽段反应确实发生在肽段n端。虽然精氨酸和赖氨酸的侧链碱性基团也有可能会和ｈｎｏ２发生反应，但在本实验条件下，并没有看到精氨酸残基与亚硝酸盐的反应物。而在p1肽段中，恰好是以赖氨酸在n端开头。
图2 p1肽段的二级质谱图（略）
fig.2 tandem mass spectra of reaction products of p1 with nitrous acid
(a) 原肽段p1 （m/z 1550.9）的二级质谱图（the tandem mass spectrum of p1（m/z 1550.9））; (b) 与ｈｎｏ２反应产物肽段p1_2 （m/z 1551.8）的二级质谱图（the tandem mass spectrum of p1_2 （m/z 1551.8））; (c) 与ｈｎｏ２反应产物肽段p1_1 （m/z 1533.8）的二级质谱图（the tandem mass spectrum of p1_1（m/z 1533.8））。
为了进一步确证赖氨酸的侧链氨基是否在本实验条件下也发生了与ｈｎｏ２的化学反应，将另外一个合成的标准肽段p2（氨基酸序列：iyysmnvevtdk, 分子量：1460.5 da）与亚硝酸盐在与p1肽段相同的反应条件下进行反应，并应用malditofms分析，结果如图3 所示。可以看到在没有加入ｈｎｏ２的对照溶液中，仅能看到p2肽段的质子化离子峰 m/z 1461.7((p2+h)+)。而在加入ｈｎｏ２的反应体系中，有两个明显的产物质谱峰出现，分别为m/z 1462.7（（p2_2+h）+）和m/z 1444.7（（p2_1+h）+）。同样，产物p2_1的分子量比原肽段p1的分子量少17 da，而产物p2_2的分子量比原肽段p1多1 da。为了确证是肽段的n端氨基还是c端的赖氨酸的侧链氨基发生了取代或消除反应，实验将m/z 1462.7（（p2_2+h）+）选作母离子进行串联质谱分析，结果如图4所示。在p2_2的二级质谱图中的y离子（图4b）与原肽段p2的y离子（图4a）相比没有任何质量数的变化；而p2_2的二级质谱图中的连续的b离子与原肽段p2的连续的b离子相比均有1da的质量数的增加。这说明p2肽段的n端氨基与ｈｎｏ２发生了化学反应，而赖氨酸侧链的氨基并没有发生此反应。这与实验所推测完全一致。从而说明，在本实验条件下，肽段的赖氨酸侧链氨基并没有与ｈｎｏ２发生重氮化反应，产物p2_1是由于ｈｎｏ２和肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，进一步发生消除反应，脱掉1分子的氨，进而生成的烯烃衍生物；产物p2_2则是ｈｎｏ２和肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，再与羟基发生取代反应生成的羟基取代n末端氨基的产物，即在肽段的n末端的氨基被羟基替换，从而导致产物的分子量比原肽段多1 da。反应原理图如图5所示。
图3 标准肽段p2与ｈｎｏ２反应的一级质谱图（略）
fig．3 ｍass spectra of reaction products of p2 with nitrous acid
(a) 不加ｈｎｏ２的对照组样品质谱图（the mass spectrum of control sample without nitrous acid）; (b) 加入ｈｎｏ２的反应样品质谱图（the mass spectrum of reaction products of p1 with nitrous acid）。
图4 p2肽段的二级质谱图（略）
fig．4 ｔandem mass spectra of reaction products of p2 with nitrous acid
(a) 原肽段p2 （m/z 1461.7）的二级质谱图（the tandem mass spectrum of p2 （m/z 1461.7））； (b)与ｈｎｏ２反应产物肽段p2_2 （m/z 1462.7）的二级质谱图（the tandem mass spectrum of p2_2（m/z 1462.7））。
图5 ｈｎｏ２与肽段n端氨基反应机理（略）
fig.5 mechanism of reaction of amino group of nterminal of peptides with nitrous acid
3.2 不同的反应条件对肽段与ｈｎｏ２反应完全程度的影响
实验考察了不同的酸种类、不同的反应时间和不同的缓冲盐体系对肽段与ｈｎｏ２反应产物的影响。当采用hcl体系时，考察不同的反应时间对反应完全程度的影响。结果表明，反应40 min 时，反应产率达到最大值92%，时间再延长至2 h，反应产率缓慢降到83%。这说明，当采用hcl体系时，肽段的n末端氨基很难与ｈｎｏ２完全反应最终全部生成羟基取代产物和消除反应的烯烃产物。
而当采用0.1%乙酸体系、50 mmol/l nah2po4(ph=6)的缓冲体系或 1 mol/l乙酸溶液，其它条件与上述相同。结果表明，只有当采用1 mol/l乙酸溶液时，肽段的n端氨基才能与ｈｎｏ２完全反应，生成最终的反应产物。
因此，实验又考察了在乙酸体系中，不同的反应时间以及不同的乙酸浓度对反应产物的影响。首先，配制1 mol/l hac溶液，1 mol/l nano2溶液，取5 μl p1肽段（1g/l）, 加10 μl nano2, 再加10 μｌ乙酸，轻轻震荡, 室温放置5 min、15 min、30 min、45 min和1 h, 分别脱盐点靶，进行质谱分析。以质谱峰强度（i1533＋i1551）/i1550 的比值作为考察反应完全程度的指标。结果表明，室温放置5 min,肽段与ｈｎｏ２即可反应完全。
考察ｈｎｏ２浓度对反应完全程度的影响。按实验方法2.2.4节进行操作，如表１所示。结果表明，当乙酸和ｎano2的浓度均小于0.1 mol/l时，反应几乎不发生; 当乙酸和nano2的浓度均为1 mol/l以上时，（i1533＋i1551）/i1550 大于99％，表明反应进行完全。
表１ 采用乙酸体系，不同的乙酸/nano2浓度对肽段反应完全程度的影响（略）
table 1 effect of concentration of acetic acid and sodium nitrite on the reaction completeness of peptide with nitrous acid in acetic acid solution
3.3 ｈｎｏ２与肌红蛋白酶切肽段混合物的反应
为了考察在上述条件下，对于不同的肽段是否也能与ｈｎｏ２反应完全，实验将肌红蛋白酶切肽段混合物作为标准模型。为了提高蛋白覆盖率和肽段在质谱上的检测灵敏度，将蛋白的赖氨酸进行胍基化修饰，以便观察到尽可能多的肽段。
3.3.1 肌红蛋白酶切及胍基化反应 结果如图6所示。在上述反应条件下，所有的赖氨酸的侧链氨基均被胍基化修饰。与未被胍基化的肽段质谱图相比，当肽段的c端赖氨酸侧链氨基被胍基化封闭后，其质量数比原肽段增加42（若肽段含有多个赖氨酸，则质量数相应增加42的倍数）。且质谱峰强度明显高于原来肽段，蛋白覆盖率几乎达到100％。
图６ 肌红蛋白酶切肽段的赖氨酸侧链氨基胍基化反应质谱图（略）
fig．６ ｍass spectra of trypsic peptides of myoglobin with amino group of lys blocked through guanidation
(a)为肌红蛋白酶切肽段混合物的一级质谱图（the mass spectrum of trypsic peptides of myoglobin）; (b) 赖氨酸侧链氨基胍基化反应后的酶切肽段混合物的一级质谱图（the mass spectrum of trypsic peptides of myoglobin with amino group of lys blocked through guanidation）。
3.3.2 胍基化肌红蛋白酶切肽与ｈｎｏ２的反应 取10 μl上述胍基化肽段，加20 μl 1 mol/l nano2、20 μl 1 mol/l hac, 37 ℃ 震荡反应5 min,脱盐进行质谱分析；结果如图7所示，与对照样品质谱图（图７a）相比较，在加入亚硝酸盐的样品质谱图中，明显看到几乎所有肽段都比原肽段有1个质量数的增加，且同时伴有原肽段质量数减17的峰出现，同时，原肽段的质谱峰在与亚硝酸盐反应的样品的质谱图中消失，说明所有肽段的n端氨基均完全与ｈｎｏ２发生了亚硝化反应生成了相应的取代产物（m＋1）和消除产物（m17）。结果表明，几乎所有的肽段的n端氨基均能在上述反应条件下与ｈｎｏ２反应完全。
图７ 胍基化肌红蛋白酶切肽段与ｈｎｏ２反应质谱图（略）
fig．7 ｍass spectra of reaction products of trypsic peptides of myoglobin with amino group of lys blocked with nitrous acid
(a)胍基化后的酶切肽段（the mass spectrum of the trypsic peptides of myoglobin with amino group of lys blocked）； (b)胍基化后肽段与ｈｎｏ２反应的质谱图（the mass spectra of reaction products of trypsic peptides of myoglobin with nitrous acid after lys residues blocked through guanidation）。
3.4 结论
no－２广泛分布于生物体的血液和组织中，能使蛋白质发生硝基化和亚硝基化修饰，并且调控生物体的多种生理过程。本研究应用高灵敏度的基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱（malditofms）技术，以合成的标准肽段和肌红蛋白为模型系统，研究了蛋白质和多肽主链n端氨基与赖氨酸侧链氨基对ｈｎｏ２反应的敏感性，并考察了不同的反应体系和不同的反应时间对ｈｎｏ２与多肽的反应完全程度的影响。结果表明，ｈｎｏ２能与肽段n端的伯氨基发生重氮化反应，形成的叠氮化中间产物不稳定，放出氮气形成碳正离子，碳正离子可进一步发生取代或消除反应。发生取代反应，水溶液中的羟基取代n末端氨基形成m+1产物，既使得产物比原肽段分子量多1 da；发生消除反应，脱掉1分子的氨，进而生成m17烯烃衍生物，从而使产物比原肽段分子量少17 da。当采用1 mol/l乙酸和1 mol/l nano2作为反应体系时，反应5 min, 肽段的n端氨基即可完全与ｈｎｏ２反应生成羟基取代产物和烯烃衍生物。而在上述条件下，未发现赖氨酸侧链氨基与ｈｎｏ２反应，说明ｈｎｏ２主要与肽段和蛋白的n端氨基发生反应。此研究结果可以为深入研究体内亚硝酸盐与蛋白质和多肽的相互作用提供重要的信息。
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