【摘要】 本工作研究了冷消解、微波消解、高压密闭消解方法对超声破碎后细胞中砷的icpms测定的影响，并与直接进样测定结果作对比。结果表明，微波消解法和高压密闭消解法效果较好，测定的精密度以rsd表示，分别为2.1％和1.2％；日间6次测定的精密度分别为1.２％和２.０％；元素加标回收率均在95.7％～108.1％范围。用４种消解方法对应的icpms方法检出限介于0.74～0.93 μg/l之间，符合痕量分析要求。本工作还建立了高效液相色谱(hplc)与电感耦合等离子体质谱(icpms)联用技术对1 μmol/l染砷组细胞样品中的砷化学形态进行了初步探讨，发现细胞内除了存在无机砷(as(ⅲ)和as(ⅴ))外，同时存在二甲基砷(dma)和一种甲基砷中间代谢产物。
【关键词】 细胞消解 高效液相色谱 电感耦合等离子体质谱 肝细胞 砷化学形态
1 引言
砷是人体中最丰富12种元素之一，同时砷也是人类确认的致癌毒物[1,2]。长期接触砷会对人体多种组织、器官造成危害，严重损害人类健康[3]。近年来，随着人们对健康程度的重视，砷在人体内代谢过程的研究越来越受到人们的关注。由于砷的毒性很大，因而不能直接进行人体内代谢实验。有研究报告不同物种之间的砷代谢过程存在很大差异，即使与人同属灵长类的猩猩，其体内对砷代谢与人类相比也具有非常大的差异[4]，因而动物体内代谢实验只能对研究人体内砷代谢机理提供一个参考数据。基于此，目前该领域的研究人员多倾向于通过研究人体细胞对外源砷的代谢过程以揭示砷在人体中的代谢机理。
准确的砷测定方法在细胞中砷代谢过程的研究中起到至关重要的作用。目前细胞中砷元素的总量测定方法报道较少，尤其是样品前处理方法。研究者通常是通过简单的细胞破碎后直接测定砷元素含量或者通过冷消解的方式来实现溶液的均一化[5]。研究发现，由于细胞破碎的效率较低，并不能得到稳定均一的溶液，而采用冷消解时消解时间很难把握，而且消解效率不高。本工作将以chang肝细胞为研究对象，在细胞破碎的基础上对比了3种不同消解方法对细胞中砷总量测定结果的影响，从而寻找最佳的细胞消解方法。此外，在总量测定的基础上，本文将探讨细胞中砷化学形态的分析方法，以期为砷代谢机理的研究提供可用的分析方法学。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
7500a型电感耦合等离子体质谱仪(icpms, 美国agilent公司)；1100型高效液相色谱(hplc, 美国agilent公司); hamilton prpx100(250 mm×4.1 mm， 10 μm)阴离子交换色谱柱；speed wave mw3+ 微波消解系统(德国berghof公司)； milliq超纯水处理系统(美国millipore公司)；al104 型电子天平(瑞士mettlertoledo公司)；二氧化碳恒温培养箱(heraeus公司)。
naaso2(分析纯,上海试剂二厂)；rpmi 1640培养基(美国gibco公司)；hno3、h2o2为优级纯(德国merck公司)；(nh4)2co3为分析纯；超纯水(18.2 mω cm)由milliq超纯水系统制得；agilent多元素混标(part#51834687)，agilent内标(part#51834682)，10 μg/l li、y、ce和tl的调谐液(美国agilent公司)；asi3、as2o5(美国alfa aesar公司)；二甲基胂酸(dma, 美国acros organics公司)；甲基胂酸(mma)、砷胆碱(asc)、砷甜菜碱(asb)(清华大学)；人张氏肝实质细胞(chang liver cell)购自中科院上海细胞库。
2.2 实验方法
2.2.1 细胞染砷及收集 染砷细胞样品是与沈阳中国医科大学合作培养获得。细胞经复苏、传代后，按不同浓度划分，共设置4组(即4个六孔版)，每块六孔板第一个孔为不染砷对照样，其它5个孔为染砷样。将密度约为1×105个/ml的chang肝细胞接种于六孔板的培养皿中，每孔加入4 ml rpmi 1640培养基（内含10%胎牛血清、100 u/ml的青、链霉素)。将细胞继续在co2培养箱中放置24 h，待细胞完全贴壁且生长状态稳定后，分别加入用培养基配制的终浓度为1、5、10和20 μmol/l的naaso2溶液，37 ℃、5%co2孵育24 h。
在达到规定培养时间后，去除细胞培养液，用pbs反复冲洗。用细胞刷刮下六孔板各孔内贴壁细胞，转移到5.0 ml离心管中(每管大约1.0 ml样品，约含2.5×106个细胞)，超声破碎后密封，于－70 ℃下进行保存。
2.2.2 细胞样品前处理 (1)直接测定：将约含2.5×106 个细胞的超声破碎后的样品经超声混匀后用超纯水稀释约10倍，定重，以89y为内标，直接进样进行icpms测定。(2)冷消化法：参考文献[5]方法对细胞进行冷消化，即将约含2.5×106 个细胞的超声破碎后的样品以1×105 r/min离心15 min，令残留细胞及细胞残体聚集于塑料管底部，在每个塑料管中加入1.0 ml优级纯hno3和200 μl h2o2。待底部沉淀变成黄黑色时轻轻弹振塑料管，令沉淀上浮样品在室温下静置24 h，再度离心5 min以目测看不到残渣为消化完全。每个样品用超纯水准确稀释约10倍定重，而后以89y为内标，进行icpms测定。(3)高压密闭容器消解法：将约含2.5×106 个细胞的超声破碎后的样品,置于酸蒸洗净的ptfe消解罐中，加入2 ml hno3，放烘箱中80 ℃预消解2 h然后升温至170 ℃消解2 h, 待冷却后加入200 μl h2o2，反应5 min，然后将样品移入pet瓶中，用超纯水稀释约10倍，定重，即为待测溶液。(4)微波消解法：将约含2.5×106个细胞的超声破碎后的样品，置于酸蒸洗净的ptfe消解罐中，加入2 ml hno3，然后按照leaf程序消解，冷却后加入200μl h2o2，反应5 min，然后将样品移入pet瓶中，用超纯水稀释约10倍，定重，即为待测溶液。
2.2.3 标准溶液的配制 用5% ｈｎｏ３逐级稀释砷标准，浓度梯度(以砷计)为0.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/l。用超纯水配制10 mg/l的混合asc、asb、as(ⅲ)、dma、mma和as(ⅴ)（以砷计）储备液。
2.2.4 icpms测定细胞中的砷总量 为了提高砷测定灵敏度，用10 μg/l的li、y、ce和tl混合标准溶液调整仪器各项指标（见表1），使仪器灵敏度、氧化物、双电荷等各项指标均达到测定要求。在线引入内标，对空白溶液、标准溶液、待测溶液依次进行测定。
表1 agilent 7500a icpms 工作参数（略）
table 1 operating conditions of agilent 7500a icpms
2.2.5 hplcicpms分析染砷细胞中砷化学形态
（１）样品处理：为保证砷在样品中所存在形态不发生变化，细胞样品从－70 ℃超低温冰箱取出后吹入高纯氮气，置于4 ℃冷藏冰箱解冻，解冻后的样品经超声混匀，过0.45 μmol/l醋酸纤维膜后直接进样测定。(2)hplc条件：hamilton prpx100阴离子交换色谱柱(250 mm×4.1 mm×10 μm)；流动相为：a. h2o，b. 50 mmol/l (nh4)2co3(ph=9.5)，二元泵梯度程序为0～15 min，100%～0% a， 0%～100% b；15～30 min， 0%～100% a，100%～0% b；流速1.5 ml/min，进样体积20 μl。(3)icpms条件：rf功率1350 w，载气为高纯氩气，载气流速1.08 l/min，停留时间分别为75as(0.5 s)、72ge(0.1 s)、35cl(0.1 s)、77se(0.1 s)、83kr(0.1 s)。
3 结果与讨论
3.1 不同处理方法砷总量测定对比
生物样品的消解处理方法多采用湿法消解，而湿法消解包括敞开式湿法消解和密闭湿法消解。虽然敞开式消解步骤简单，样品处理量大，但由于砷即便在较低温度就可转化为挥发性的二聚物或单氧化物从而造成损失，因而敞开式消解并不适合砷的测定。所以密闭湿法消解是生物样品中砷s前处理方法的首选。密闭湿法消解是在密闭空间内采用强酸性或强氧化性的试剂对样品进行液体化、均一化的过程，其又可分为高压密闭容器消解、微波消解、冷消解等方法。密闭容器消解与微波消解法均在密闭消解罐中用强酸消化处理样品，区别在于前者采用在烘箱中外加热消解罐使样品消解，而后者则利用微波的穿透性和激活能力，内加热密闭容器中的试剂和样品，而冷消解法主要是针对有机物含量较低的样品的消解方法。其不通过加热仅靠试剂本身的酸性和氧化性对样品进行消化。表2显示了不同消解方法之间的对比结果。从表2中可看出，用微波消解法和高压密闭消解法处理样品时细胞内砷总量测定的差异较小，而用冷消解和直接进样法时坤测定的结果则低于其它两种方法的结果，尤其是用直接进样法测定的结果仅为用微波消解法时的50%左右。多次测定结果的相对标准偏差(rsd)表明，当用微波消解、高压密闭消解法时，多次测定的标准偏差最小，其次为冷消解方法，最次为直接进样测定。这可能是由于细胞样品破碎不完全，样品中残留未破碎的细胞，因而直接进样测定时，样品测定的稳定性稍逊于消解后的样品。而通过冷消解处理后的样品，虽然样品的均一性有了提高，但是相对于加热消解的方法来说尚有差距。微波消解法和高压密闭消解法的测定结果无显著性差异，但后者耗时长、易引入污染;而前者耗时短，空白低，易挥发元素砷损失更少。根据以上的比较，本工作选择微波消解法进行细胞样品处理。
表2 4种消解方法测定染砷细胞中砷总量的比较(n=3)（略）
table 2 comparison of 4 digestion methods（μg/l, n=3）
3.2 干扰及消除
应用icp－ms进行分析生物样品中砷的测定干扰问题需要解决。其干扰包括质谱干扰和非质谱干扰两类。质谱干扰的产生是由于生物样品中的35cl元素含量一般较高，35cl与等离子体中的载气ar2形成40ar35cl多原子离子影响测定结果。本工作通过稀释样品来降低cl－浓度，并采用优化仪器条件和选择合适的干扰校正方程来进行测定校正。实验中编辑干扰方程75as＝75m－77m(3.127)+82m(2.733)－83m(2.757)来校正砷的多原子离子干扰。非质谱干扰主要源于样品基体，基体效应会对待测元素产生抑制作用。克服基体效应最有效的方法是稀释样品、内标校正、标准加入、基体消除等。本实验通过加入1.0 mg/l 89y溶液作内标在线监测信号变动情况，可有效克服仪器漂移，保证测量的准确性。
3.3 线性范围及精密度
测定0～200 μg/l的砷标准溶液系列，砷的分析信号值与浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.9998，icpms具有极宽的线性动态范围，能保证样品分析在有效范围内。
用４种方法对1 μmol/l染砷组平行测定7次，计算其相对标准偏差考察精密度，结果见表3。表中结果显示，与微波消解和高压密闭消解法相比，直接进样和冷消解的精密度明显偏低。而高压密闭消解法(rsd=1.21)的当日精密度略优于微波消解法(rsd=2.1)。
此外，本实验通过对4种前处理方法处理后1 μmol/l染砷组的样品连续测定6 d（每天一次）得到了不同方法的日间精密度，结果列于表3。由表3可见，直接进样的日间精密度最差，其次为冷消解，其rsd均超过10。而其它２种方法均显示了较高的日间精密度。对比微波消解法和高压密闭消解法的精密度发现，虽然高压密闭消解法的日内精密度较高，但其日间精密度略高于微波消解法。
表3 测定精密度及日间精密度测定（略）
table 3 measurement precision and interday precision
表4 检出限及加标回收率测定（略）
table 4 detection limits and spike recovery
3.4 方法检出限及回收率
平行测定11次空白溶液，计算3倍的相对标准偏差，其对应的浓度值为其检出限，结果见表4。
由于缺少细胞样品的标准参考物质，本实验采用加标回收的方法判断测定方法的准确性。对于5 μmol/l组染砷样品加入浓度相当于100％本底浓度的砷标准溶液，采用4种方法平行处理加标样品，最后测定溶液中砷含量，计算加标回收率，结果见表4。回收率实验显示除直接进样外，其它3种消解方法的回收率均在84.1%～108.1％之间，显示了较好的方法准确性。
3.5 细胞样品中有机砷形态的测定
无机砷（主要指iasⅲ）进入人体后，在酶的作用下会发生甲基化作用，这是人体砷代谢的主要途径[6～8]。砷在人体的甲基化过程主要发生在肝脏中，肝脏是人体代谢外源砷的主要器官[9～10]。目前对肝脏中砷甲基化的机理尚不清楚，但是通过对肝脏中甲基化砷（主要为mma和dma以及一些中间代谢产物）的测定和表征可以反映人体对砷的代谢程度，尤其是对慢性砷中毒的患者，通过对其体内甲基化砷的测定可以判定其代谢情况，从而对其治疗效果提供一个可评判的依据。另一方面，通过对肝脏中砷代谢产物的测定和表征可以对其代谢机理研究的准确性提供直观的判定。
本工作选用（ｎｈ４）２ｃｏ３和ｈ２ｏ为流动相，考察了在不同梯度下对asc、asb、dma、mma、as(ⅲ)和as(ⅴ) ６种砷标准的洗脱能力，并改进了其分离方法。用上述2.2.5方法（１）中所列梯度及其它条件分别对20 μg/l ６种砷化学形态(asc、asb、dma、mma、as(ⅲ)和as(ⅴ))标准溶液进行分析，确定其不同保留时间；用纯水配制上述６种砷化学形态的混合标样并用hplcicpms分离测定，其色谱图如图1所示。由图１看出，在此梯度条件下基本实现了６种砷化学形态分离。
图1 10 μg/l的asc,asb,as(ⅲ),dma,mma和as(ⅴ)混合标样的hplcicpms色谱图（略）
fig.1 hplcicpms chromatographic spectrum of 6 mixed as species standards
1. arsenocholine(asc)； 2. arsenobetaine(asb)； 3. as(ⅲ)； 4. dimethylarsinic acid(dma)； 5. monomethylarsinic acid(mma)； 6. as(ⅴ).
根据上述分离条件对1 μmol/l染砷组样品进行分析，如前所述，细胞样品中35cl含量较高易与icpms工作气体 ar生成40ar35cl+，造成质谱干扰，因而在对样品中砷化学形态进行分析时，采用时间分辨分析模式，仪器同时监测75as,72ge,35cl,77se,83kr的信号，用以排除40ar35cl+干扰峰[10]。图１显示了1 μmol/l染砷组样品的砷总离子流图。由图１可看出，样品中砷主要是以as(ⅴ)的形式存在，可能为未被肝细胞代谢的as(ⅲ)氧化产生。此外谱图中还存在少量的as(ⅲ), dma以及一种暂无法确定的砷化物。
图2 1 μmol/l染砷组样品砷化物hplcicpms色谱图（略）
fig.2 hplcicpms chromatographic spectrum of as species compounds in 1 μmol/l group
a. 未经h2o2处理（without h2o2 treatment）； b. 经h2o2处理(with h2o2 treatment).
虽然目前对肝脏中砷甲基化的假说很多，但有一点已达成共识[11,12]：无机砷在肝脏内的代谢过程遵循一个基本的流程即as(ⅴ)首先还原为as(ⅲ)，而后通过甲基化作用首先形成mma。mma通过一系列中间代谢产物再次甲基化形成dma，而dma为肝脏甲基化代谢无机砷的最终产物[9]。图２a中显示dma的存在,说明砷在肝细胞中的甲基化作用确实存在。考虑到谱图2a中未发现mma，因而可以推测未知峰可能为mma发生二次甲基化过程中的中间代谢产物.为了证实这个假设，本实验在该样品中加入了适量的h2o2，静置4 h后重新测定其含有的砷形态，结果见图２ｂ。对比图2ａ和图2ｂ可以发现，经h2o2处理样品后，原来存在的未知峰和as(ⅲ)均不存在了，取而代之的是出现了mma的色谱峰且as(ⅴ)峰的面积增大25％左右(as(ⅲ)氧化的结果)。有报道指出[13]，适量的h2o2可以使砷与巯基结合键断裂。由此可以推断未知峰极有可能为mma甲基化为dma时的中间代谢产物。由于目前各种砷在肝脏中代谢理论的假说的不同点体现在砷甲基化的中间代谢产物上[11，12]，即若能准确表征砷代谢的中间产物即可判定各种假说的真实性。因而本工作所建立的分离方法对砷代谢理论的发现可提供了重要的支持。
4 结论
本研究较系统地比较了３种肝细胞的消解方法，采用高压密闭消解法和微波消解法时，砷的测定结果、测定精密度、日间精密度及加入回收率均优于用直接进样和冷消解法时的结果。如果进一步考虑到样品处理时间等因素，本研究推荐采用微波消解法作为细胞中砷总量测定时的样品处理方法。本工作建立了hplcicp/ms联用技术分析细胞样品中甲基化砷的方法，实验发现了一种甲基砷的中间代谢产物，可对判定目前砷代谢理论各种假说的真实性提供技术支持。
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