大鼠在体小肠吸收实验思考题答案(大鼠在体小肠吸收实验讨论)

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【摘要】 目的：探讨共刺激分子及黏附分子在大鼠实验性结肠炎发病中的作用。方法：建立三硝基苯磺酸诱导的实验性结肠炎大鼠模型，并予以泼尼松或柳氮磺胺吡啶治疗，设立正常对照及未治疗组对照，进行组织学评分；流式细胞仪检测各组外周血、脾脏和结肠上皮内单个核细胞cd28、ctla4及cd11b的表达。结果：实验性结肠炎大鼠在外周血、脾脏和结肠表达cd11b、cd28及ctla4均较正常对照组升高，有统计学意义，而经泼尼松或柳氮磺胺吡啶治疗后在结肠的cd11b和cd28的表达有所回落，而ctla4升高更加明显，均有统计学意义。结论：黏附分子可能参与了大鼠实验性结肠炎的发生，cd28与ctla4表达失调可能是发病机制之一，泼尼松和柳氮磺胺吡啶的治疗机制可能与共刺激分子及黏附分子有关。

【关键词】 结肠炎 三硝基苯磺酸 共刺激分子 黏附分子

　　costimulatory molecules and adhesion molecules in experimental colitis of rats

　　chen ning,liu yulan.

　　department of gastroenterology,people’s hospital,peking university,beijing 100044,china

　　［abstract］ objective:to investigate costimulatory molecules and adhension molecules in the pathogenesis of experimental colitis in s:models of experimental colitis were established by enema with trinitrobenzenesulphonic acid. prednisolone or salicylazosulfapyridine was given as rat and untreated colitis rat groups were set up as ogical scoring was sion of cd11b,cd28 and ctla4 were detected by flow cytometry in peripheral blood，spleen and intraepithelial mononuclear cells of s:expressions of cd11b,cd28 and ctla4 were high in experimental colitis. cd11b and cd28 decreseased after treatment of prednisolone or salicylazosulfapyridine,while ctla4 increased further,which were significant sion:adhesion molecules may have a role in the pathogenesis of experimental dysregulation of cd28 and ctla4 may be one of the mechanisms in mechanisms of prednisolone and salicylazosulfapyridine may be associated with costimulatory molecules and adhension molecules.

　　［key words］ colitis；trinitrobenzenesulphonic acid；costimulatory molecules；adhension molecules

　　炎症性肠病（inflammatory bowel disease,ibd）的发病机制尚未完全明了，目前认为ibd可能是机体对原本耐受的共生菌抗原发生免疫反应，导致结肠免疫炎症的发生［1］。该病理过程涉及到抗原递呈细胞（apc）对自身抗原的提呈、自身反应性t 细胞的活化以及炎症反应的发生。作为t细胞活化共刺激信号的cd28及其同族的ctla4(cytotoxic t lymphocyte antigen4)在免疫反应的调节方面有着重要作用，而黏附分子cd11b为炎症的早期反应、血管损伤的关键步骤。本实验建立三硝基苯磺酸（tnbs）诱导的实验性结肠炎大鼠模型，并予以激素或柳氮磺胺吡啶（sasp）治疗，检测不同组之间外周血、脾脏及结肠内单个核细胞cd28、ctla4及cd11b的表达，并探讨它们在ibd发病中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 雄性sd大鼠,10～12周龄，体重220～250 g，购自北京实验动物中心，北京大学人民医院动物中心spf级实验室饲养。

　　1.2 试剂 tnbs购自sigma公司；小鼠抗大鼠cd28rpe抗体、小鼠抗大鼠ctla4rpe抗体、小鼠抗大鼠cd11bfitc抗体均购自serotec(oxford, 英国)。rpmi1640和胎牛血清(fbs)分别为gibco brl和hyclone生产，淋巴细胞分离液购自上海恒生化学试剂厂。

　　1.3 分组 32只sd大鼠随机分为4组：正常对照组、结肠炎未治疗组、结肠炎泼尼松治疗组和结肠炎sasp治疗组，每组8只（tnbs灌肠后第3天死亡1只，故结肠炎组为7只）。

　　1.4 模型建立 除正常对照组外的24只大鼠建立结肠炎模型：灌肠前禁食24小时，乙醚麻醉，聚乙烯管插入直肠8 cm，将含有20 mg tnbs的50%乙醇溶液0.5 ml灌入结肠,保持肛门高位5分钟，防止药物流出［2］。正常对照组以等体积生理盐水灌肠，其余过程均相同。灌肠后约1周左右成为结肠炎模型。

　　1.5 治疗 于tnbs灌肠后1周开始，泼尼松及sasp（上海三维制药有限公司)剂量分别为1及100 mg/（kg·d）。灌胃每天1次×2周，结肠炎未治疗组予以生理盐水灌胃作为对照。各组大鼠均于第3周处死。

　　1.6 肠道组织学评分 留取距肛门6 cm的肠道组织(长0.5 cm) 福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，he染色，盲法阅片并计分，标准参考文献［3］。0分：无明显炎症；1分：少量淋巴细胞浸润（≤10%高倍视野），并无结构的改变；2分：中量淋巴细胞浸润（11%～25%高倍视野），隐窝变长，肠壁增厚，但未透过黏膜层，无溃疡形成；3分：明显淋巴细胞浸润（26%～50%高倍视野），血管密度增加，肠壁增厚，透过黏膜层；4分：大量淋巴细胞浸润（>50%高倍视野），血管密度增加，隐窝变长并扭曲，肠壁全层增厚，可见溃疡形成。

　　1.7 单个核细胞提取及流式细胞检测 脾脏、外周血淋巴细胞及结肠上皮内淋巴细胞提取按传统ficol梯度离心方法进行［4］。所提取的细胞流式细胞仪检测cd28、 ctla4及cd11b表达（facs calibur）。

　　1.8 统计学处理 采用spss 11.0软件进行统计学分析，先用f检验,验证方差齐性，再进行t检验, p<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 32只大鼠tnbs灌肠后，平均3～5天左右出现典型的炎症性肠病症状（腹泻、便血、体重下降等），在第3天死亡1只。正常对照组则出现体重增加。两种药物治疗组腹泻、粘液脓血便等症状均明显好转，体重不再明显下降。

　　2.2 病理学变化 结肠炎未治疗组组织学评分（3.5±0.7）明显升高，与正常对照组（0.5±0.3）比较差异具有统计学意义（p=0.002，<0.05）；泼尼松（2.0±0.3）和sasp治疗组（1.8±0.4）与未治疗组比较评分明显下降，差异有统计学意义（p值分别为0.042及0.039，<0.05）。

　　2.3 黏附分子cd11b的表达情况 具体值参见表1。结肠炎未治疗组大鼠外周血表达cd11b显著高于正常，有统计学意义（p＝0.011），泼尼松和sasp治疗组与未治疗组比较无明显变化（p＝0.87及0.84）；脾脏cd11b表达情况与外周血相似；在结肠，结肠炎未治疗组cd11b表达与正常比较明显上升，有统计学意义（p＝0.000），泼尼松和sasp治疗组与未治疗组比较有所下降，有统计学意义（p＝0.009及0.002）。正常对照组外周血的cd11b表达与结肠表达相近（p＝0.944），而结肠炎未治疗组的结肠局部cd11b表达显著高于外周血的表达，有统计学意义（p＝0.000）。

　　2.4 共刺激分子的表达情况 见表1。

　　2.4.1 cd28 结肠炎未治疗组外周血cd28显著高于正常对照组，有统计学意义（p＝0.008），泼尼松和sasp治疗组与未治疗组比较均无差异（p分别为0.14及0.063）；脾脏的表达情况与外周血相似；在结肠，结肠炎未治疗组表达cd28也显著高于正常对照组，有统计学意义（p＝0.007），泼尼松和sasp治疗组与未治疗组比较有所回落，有统计学意义（p＝0.000及0.006）。

　　2.4.2 ctla4 在外周血，结肠炎未治疗组ctla4表达高于正常对照组，有统计学意义（p＝0.005），泼尼松和sasp治疗组与未治疗比略有下降，但差异无统计学意义（p分别为0.35及0.07）；脾脏的表达与外周血相似；在结肠，结肠炎未治疗组表达ctla4也高于正常对照组，有统计学意义（p＝0.003），而泼尼松和sasp治疗组与未治疗相比ctla4更高，且差异无统计学意义（p分别为0.04及0.03）。

　　表1 单个核细胞膜表面标志物表达情况（略）

　　tab.1 expression of membrane markers in mononuclear cells

　　note:eral blood mononuclear cells， mononuclear cells，pithelial mononuclear cells of colon. compared with normal control,1) p<0.05;compared with untreated control,2) p<0.05.

　　3 讨论

　　在ibd的病程中，t细胞扮演了重要的角色，而共刺激分子在t细胞活化过程中起着重要作用［1，5］。t细胞被诱导增殖分化成效应细胞时需要双信号的作用，第一信号是抗原识别；第二信号为抗原非特异性的共刺激信号，由t细胞上的共刺激分子与apc的配体结合所诱导，启动维持并调节活化级联反应，决定了t细胞是活化增殖或者转变为无反应状态甚至凋亡［6］。cd28是最重要的共刺激分子，其配体是主要表达于apc上的b7家族。ctla4在结构上与cd28分子高度同源，在静止细胞上微量表达，于活化的t细胞上表达上调，它与b7分子的亲和力显著高于cd28，通过竞争性阻断b7cd28共刺激通路而对t细胞反应起负性调节作用［7］。cd28、ctla4与t细胞和apc之间的相互作用是动态且复杂的免疫调节过程，弄清这个过程，有助于我们更好的理解ibd的发病机制。

　　本研究发现在tnbs诱导的大鼠实验性结肠炎中，外周血、脾脏及发生炎症的结肠局部单个核细胞的cd28表达均较正常大鼠增加，提示在发生结肠炎时外周循环及结肠局部t细胞均处于免疫活化状态，经治疗后表达回落，说明t细胞的活化受到了抑制。而ctla4作为免疫反应的负性调节信号，在发生结肠炎时外周血、脾脏及结肠的表达也有所上升，说明在炎症发生时，不但有cd28的表达增高来协助t细胞的活化，同时也有负性调节信号的增高来抑制t细胞的活化，而炎症的发展可能与上述二者的比例失调有关。在外周血和脾脏，经泼尼松或sasp治疗后cd28和ctla4与未治疗组相比无明显变化，而在结肠，两种药物治疗后均出现cd28下降和ctla4升高，我们推测两种药物均可通过抑制cd28的表达及增加ctla4的表达来减弱共刺激信号，从而减少免疫细胞的活化，发挥其抗炎的药理作用，而且这种作用主要在结肠得以发挥。

　　cd11b/ cd18属于白细胞黏附分子整合素β2亚家族成员，其表达和活性受多种趋化因子调节，可与多种配体相互作用，在细胞间黏附和炎症反应中发挥生物学作用。正常情况下，cd11b/cd18仅在单核细胞和中性粒细胞膜上呈低水平表达。当病理情况下，其表达增加，通过与内皮细胞表达的配体相互作用而介导白细胞与内皮细胞黏附，此为炎症的早期反应，血管损伤的关键步骤［8］。有报道在cd11b在冠心病、copd等多种疾病患者体内均表达增加［9，10］。本研究发现在发生结肠炎时cd11b的表达在外周血、脾脏和结肠均有所上升，而经泼尼松或sasp治疗后结肠的cd11b有所下降，为此我们推测黏附分子参与了炎症性肠病的发生，可能通过cd11b介导炎症的早期反应，同时cd11b可能为泼尼松和sasp治疗起效的机制之一。

　　综上所述， cd28与crla4表达失调可能是ibd的发病机制之一，黏附分子可能参与了大鼠实验性结肠炎的发生，已有研究实施针对共刺激分子及黏附分子阻滞，这可能为炎症性肠病的治疗开辟新的领域，值得深入探索［7，11］。

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