【摘要】 目的 构建针对人胃泌素基因的shrna干扰表达载体，观察胃泌素基因表达抑制对人胃癌细胞系bgc823细胞增殖和迁移能力的影响。方法 根据人胃泌素序列设计并构建3个靶向人胃泌素基因的shrna真核表达载体，以脂质体转染的方法将胃泌素干扰质粒转染至人胃癌细胞系bgc823,经g418筛选出稳定转染的阳性细胞。通过rt-pcr技术筛选出表达抑制最强的稳定转染胃癌细胞系。应用流式细胞仪技术检测其细胞周期变化情况。采用trans-well小室法检测细胞体外迁移能力。结果 经测序证明胃泌素shrna基因已成功插入psilencer3.1质粒中，构建的干扰质粒能够显著抑制胃泌素的表达。胃泌素基因的表达下调将胃癌细胞阻滞在g1期，且穿过trans-well小室膜的细胞数显著下降。结论 干扰胃泌素的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力。
【关键词】 胃泌素 shrna 迁移能力 增殖能力
gene inhibits the proliferation and migration
of human gastric cancer cell bgc823
liu yan1 , geng paili1 , lü youyong2
(1. qinghai university medical college ;
2. peking university school of oncology ，laboratory of molecular biology)
abstract objective to construct shrna expression vector target human gastrin gene and to investigate the effect of short hairpin rna (shrna) targeting on the cell cycle of gastric cancer bgc-823 cells. methods shrna expressing vectors targeting to human gastrin were designed and successfully constructed. transfectin of recombinant in gastric cancer cells bgc-823, and the stable transfectant were selected by g418. the mrna level of gastrin expression were analyzed by rt-pcr. migration capability of stably transfected cells in vitro was evaluated by using transwell chamber model. fcm was performed to detect the cell cycle. results the recombinant plasmid vector was identified by sequence analysis. rt-pcr showed that gastrin-shrna could significantly down-regulate gastrin mrna expression in bgc-823 cells. bgc823 cells were arrested in g1 phase and the trans-membrane cell number decreased significantly. conclusion knock down of gastrin gene could suppress gastric cancer proliferation and diversion by decreasing its migration capability.
key words gastrin shrna migration proliferation
胃泌素(gastrin)是胃窦部和十二指肠的g细胞分泌的一种多肽类激素，在食物消化过程中发挥重要作用。它是刺激胃酸分泌的最重要的激素，而且对胃肠道粘膜细胞有重要的营养作用。而在近20年的研究中，胃泌素作为单纯消化道激素的概念发生了巨大变化。研究发现胃泌素与其相应受体结合后以自分泌方式对消化道肿瘤细胞的增殖、凋亡及浸润转移等生物学过程进行重要调控。而今，研究者更倾向于认为对正常消化道上皮细胞和肿瘤细胞的自分泌调控作用是消化道胃泌素的最重要功能,胃泌素已成为一类重要的肿瘤自分泌生长因子[1-3]。明晰胃泌素调控作用机制在阐明消化道肿瘤的发病机制，探索有效的内分泌治疗途径方面具有十分重要的意义。
rna干扰(rna interference , rnai )是近年来发现的一种序列特异的转录后基因沉默现象，是机体用来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制[4，5]。细胞内双链rna在酶的作用下，形成20～25个碱基大小的小干扰rna(small interfering rna)，小干扰rna结合多组分核酸酶并使其激活，从而精确降解与序列相同的mrna，抑制该基因在细胞内的翻译表达。小干扰rna是研究未知基因功能的有力工具。近年来应用sirna特异性地抑制病毒体内和体外复制的研究取得了令人瞩目的成果，为sirna作为基因治疗药物的发展起到了推进作用[6]。
本实验拟构建针对人gastrin mrna的shrna(short hairpin rnas , shrna)真核表达载体，以脂质体转染人胃癌细胞系bgc823并筛选出稳定转染的细胞，观察其对胃癌细胞迁移和增殖能力的影响，从而为胃癌治疗的分子靶点筛选提供实验室基础依据。
1 材料与方法
1.1 材料
胃癌细胞bgc-823(北京肿瘤防治研究所分子生物学实验室); 载体psilencertm3.1 (ambion公司);t4dna连接酶、bamhⅰ酶、hindⅲ酶(promega公司);g418(浓度为400 μg/ml，gibco-brl公司产品);cdna 第一链合成试剂盒、rt-pcr试剂盒 (北京全式金公司 );trizol reagent(gibco-invitrogen 公司);lipofectaminetm2000 (invitrogen公司);transwell小室(bd biosciences公司);dmem养基和10%胎牛血清 (gibco公司)。
1.2 方法
1.2.1 shrna设计和合成：根据gastrin基因序列(nm_000805)、shrna设计规则及blast同源搜索选取、设计三对引物, 每一对引物上游含bamhⅰ酶切位点之后gatcc的粘性末端，引物下游互补端含hindⅲ酶切位点互补的ttcga粘性末端(由上海生物工程有限公司合成)。shrna的结构为: gatcc + sense + loop + antisense + ttcga。
1.2.2 gastrin特异的shrna真核表达载体的构建：将真核表达载体psilencertm3. 1(ambion)经bamhⅰ、hindⅲ双酶切后与含相应粘性末端、gastrin基因特异的shrna三对引物片段进行线性连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α,经无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒后测序鉴定。测序结果表明构建成功。
1.2.3 细胞培养和细胞转染：人胃癌细胞系bgc823由北京市肿瘤防治研究所高技术室保存，培养于含5%牛血清的dmem培养液中，于37℃、5%co2条件下培养。0.25%胰酶消化和传代。细胞常规培养至40%～60%汇合时按照lipofectan1ine 2000(invitrogen)操作说明书进行shrna真核表达载体(pshrna-1/2/3)和pshrna-空载体的转染。转染48 h后,用含有g418(400μg/ml)的培养基筛选，直到未转染质粒细胞完全死亡，再用含g418(400μg/ml)的培养基维持培养。挑选形成单克隆的细胞株，扩增培养用于后续分析。
1.2.4 对胃泌素mrna水平干扰效果的rt-pcr鉴定：用trizol试剂提取细胞总rna，取约4μg rna，用随机引物逆转录合成第一链cdna。以cdna( 1μl)为模板，进行常规pcr扩增。gastrin上游：5′gac gag atg cag cga cta tgt 3′，下游：5′ggg tct gcc acg agg tgt3′，扩增片段221bp。β-actin上游：5′cgg gaa atc gt gcg tga cat t3′，下游：5′cta gaa gca ttt gcg gtg gac3′，扩增片段510bp，反应体系的总体积为25μl。反应条件：第一步，95℃，5min ，1个循环;第二步，95℃，30s，62℃ 30s，72℃ 30s ，72℃ 10 min，以上反应分别进行28和26个循环。产物用1.5 %琼脂糖凝胶行电泳分离，用凝胶成像仪照相分析。
1.2.5 流式细胞仪(fcm)对细胞周期的变化检测：1ml0.25%胰消化酶消化培养皿(100mm)中的稳定干扰细胞株，镜下观察细胞形态，发现细胞形态变圆及细隙变宽，终止消化。吸出胰消化酶，加入10%fbs dmda培养液，离心(1000rpm)10min,用pbs液洗细胞两次，离心去pbs液，加入预冷的70%乙醇1 ml固定，置于4℃环境下保存。染色前用pbs离心沉淀去除乙醇固定液，并用pbs洗l～ 2次，加0.5ml 50mg/l的pi(含100mg/lrnasea)于避光处染色，上机检测，分析细胞各时相的dna含量和百分数。
1.2.6 trans-well小室法对细胞迁移能力的检测：将血清饥饿7h的四组细胞稀释成1.5×105个/0.5 ml，加入trans-well上层小室，下层加入0.75 ml 10%fbs dmem，37℃、5% co2培养24 h取出上层小室，弃培养液，用蒸馏水冲净小室内培养基，用湿棉签快速拭去聚碳酯膜上层的细胞，固定(3：1 的甲醇：冰醋酸)0.5 h后用giemsa染色1 h，用蒸馏水冲净浮色，晾干后置于显微镜下照相。
2 结果
2.1 成功构建干扰胃泌素基因的干扰载体
未转染质粒的细菌在含氨苄青霉素培养平板上不能生长;而转染pshrna阳性质粒和对照质粒的细菌均长出较多菌落，每板随机挑取10个菌落，使用质粒提取试剂盒提取重组载体，经北京奥科生物技术公司测序证明：序列完全正确。
2.2 胃泌素特异的重组体显著抑制bgc823细胞中胃泌素的表达
用重组质粒转染bgc823细胞，以空载体pshrna-vect为对照，经过22d g418筛选长出阳性克隆细胞，挑选10个阳性克隆细胞和10个空载体克隆细胞，提取克隆细胞总rna。用rt-pcr方法验证胃泌素mrna水平的表达，结果显示，与对照组相比，两个单克隆pshrna-a1和pshrna-b3内胃泌素基因表达被显著抑制(图1)。
(a)28个循环，在内参一致的情况下，干扰10个阳性克隆细胞(1-10)与空载和亲本bgc823细胞相比,目的条明显减弱，尤其1和3克隆处，这两个阳性细胞株胃泌素mrna水表达量明显下降，分别命名为pshrna-a1、pshrna-b3;(b)26个循环，10个干扰克隆细胞都显示明显的干扰效果.
图1 rt-pcr方法鉴定干扰细胞株胃泌素mrna水平的变化
2.3 干扰胃泌素表达将bgc823细胞阻滞在g1期
流式细胞仪检测实验组和对照组细胞的细胞周期，结果如下:实验组细胞(pshrna-a1，pshrna-b3)与对照组细胞(pshrna-vect，亲本bgc823)相比较，g1期细胞由66.8%升至71.6%，g2/m期细胞由空白对照组的10.6%上升为11.4%，而s期细胞由21.9%下降至17.6%(图2)。此结果表明：胃泌素干扰质粒的转染将胃癌细胞阻滞在g1期，提示干扰胃泌素表达对细胞的增殖具有抑制作用。
2.4 干扰胃泌素表达可降低细胞迁移能力
tans-well实验结果显示，pshrna-a1、pshrna-b3组细胞穿过小室聚碳酯膜的细胞数明显少于pshrna-vect组和亲本bgc823组(图3)。此结果表明：干扰胃泌素表达可显著抑制细胞的迁移能力。
图2结果显示，干扰胃泌素表达后，与空载体组和亲本bgc823细胞比较，pshrna-a1和pshrna-b3细胞的g1期数量增加，下调胃泌素表达使胃癌细胞生长阻滞在g1期。
(a)pshrna-a1 (b) pshrna-b3
(c)pshrna-vect (d)bgc823
图3 trans-well小室法检测细胞迁移能力的变化 图3显微镜下可见，干扰了胃泌素的细胞穿过trans-well小室膜迁移至膜下的能力显著低于空白对照和空载组，提示干扰胃泌素表达可抑制胃癌细胞的迁移能力。
3 讨论
gastrin是1905年英国学者edlkine在犬胃窦部首次发现并命名的。人类胃泌素基因位于第17号染色体，由三个外显子和两个内含子组成，全长411bp[7，8]。大量研究表明，与正常粘膜的胃泌素分泌不同，在肿瘤中，胃泌素可以在无内分泌功能的上皮细胞中表达，通过其受体介导细胞内一系列信号传导,促进细胞分裂和dna合成，对胃癌、结直肠癌、肺癌等消化道肿瘤有促生长作用。
本研究通过以含有真核细胞启动子的质粒为载体，将化学合成的针对人胃泌素的shrna转染入胃癌细胞株bgc823中，筛选出稳定表达gastrin-shrna的细胞株。应用rt-pcr检测pshrna表达载体的干扰效率，采用trans-well小室实验检测干扰胃泌素表达对bgc823细胞迁移能力的影响。运用流式细胞仪检测其细胞周期的变化来说明胃泌素基因表达下调后对bgc823细胞迁移和增殖的影响。pcr结果显示bgc823细胞中胃泌素表达明显受抑制。
以往研究发现，胃泌素通过其受体介导细胞内信号传导，使细胞由g0/g1期向s、g2/m期转化，促进细胞的增殖，抑制细胞凋亡。本次实验通过对下调胃泌素表达的胃癌细胞进行细胞周期的检测发现，干扰组细胞与空白对照组和亲本细胞相比，g1期及g2/m期细胞数增加，而s期细胞数下降，表明通过减低胃泌素的表达可使胃癌细胞阻滞在g1期，进一步说明了胃泌素可以促进肿瘤细胞的恶性增殖。
一些早期研究报道已确定胃泌素在肿瘤细胞的迁移中的作用，gastrin表达与其肝转移有关 ，gastrin/cck-b 受体拮抗剂治疗明显降低其肝转移发生率[9]。在本次实验中，trans-well小室检测显示，干扰组细胞穿过小室聚碳酯膜的数量明显少于对照组。表明干扰胃泌素基因表达可以显著抑制胃癌细胞的迁移能力。其中机制可能包括：gastrin通过调节癌基因产物 rhoa小g蛋白，影响细胞骨架，增强胃癌细胞的运动迁移能力，对胃癌浸润转移可能有促进作用[10 ,11]。通过引起e2钙黏着蛋白表达下调，导致肿瘤细胞脱离母体肿瘤而发生转移[12]。也可能与多种金属基质蛋白酶(mmps) ，如mmp-9[13]、mmp-11、mmp-13、mmp-14[14, 15]等 相互作用，使其表达失调，促使癌细胞发生转移。
综上所述，我们的实验证实了胃泌素与肿瘤的进程密切相关。其以生长因子的角色通过其下游所调控的相关基因参与肿瘤发展进程的多个方面，包括细胞生长、细胞转移等，在细胞的癌化过程中扮演重要的角色。胃泌素干扰技术可能成为治疗胃癌的一个有效手段。
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