病原体对不同免疫状态小鼠的感染进程(小鼠感染病原微生物及其细胞免疫现象)

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【摘要】 目的：通过观察2型登革病毒（den2）ngc株初次感染和再次感染balb/c小鼠后小鼠血浆中th1和th2类细胞因子的产生及其动态变化，研究den2感染的免疫机制。方法：用不同量的den2 ngc株经皮下多点注射，建立balb/c小鼠感染模型，间接elisa法测定感染后不同时间小鼠血浆il2、ifnγ、il4、il5、 il6、 il10的含量。结果：（1）在初、再次感染阶段，den2 ngc株各感染组产生il4、 ifnγ、 il2、il5、 il6、 il10与正常对照组有显著差异(p＜0.05)。①在初次感染阶段，ngc株各感染组血浆il2、il5、il6于第4、6、8天出现；在再次感染阶段，各感染组产生il2、il5、il6均于第1天迅速升高；il2水平于第4天达高峰（104 448.46±13 314.1 pg/ml），维持5～7天后迅速下降；il5于48小时达到高峰（135.125±46.75 pg/ml）；各组小鼠il6产生的动态相似，在再次感染后第1天，达高峰（555.823±44.639 pg/ml）后逐渐下降。②初次感染早期，il4水平明显升高，而ifnγ处于较低水平；再次感染后第1天，il4水平达最高峰（4 294.668±349.038 pg/ml），ifnγ则于第4天和第11天达较高水平，两者的产生彼消此长，且产生动态与感染病毒量有关。（2）在初、再次感染阶段，用不同量den2 ngc株感染组产生细胞因子水平有差异。结论：den2 ngc株初次和再次感染balb/c小鼠后，th1和th2应答均可发挥一定作用，二者相互影响， th细胞及其产生的ck在den感染的发病机制中起重要作用。

【关键词】 登革2型病毒 th1 th2 细胞因子

　　the study for the dynamic levels of th1/th2 cytokines in the balb/c mice infected with dengue type 2 virus ngc strain

　　chen wenjie, zuo li, pan yu，shang zhengling.

　　department of immunology，the center of tissue engineering and stem cell research, guiyang medical college, guiyang 550004, china

　　［abstract］ objective:to observe the dynamic levels of th1/th2 cytokines from the plasma of balb/c mice infected with den2 ngc strain and research immune response s:the balb/c mice plasma samples collected from different experiment groups at various time after infection were tested for il2,ifnγ,il4,il5, il6 and il10 levels with indirect s:(1)the balb/c mice could produce il2,ifnγ,il4,il5,il6 and il10 after den2 infection and the correlation of cytokines with normal group(p＜0.05).①the cytokines that appeared were il2 on the fourth day,il5 on the sixth day,and il6 on the eighth day after den2 infection;in the reinfection phase,il2 appeared on the first day with a rapid peak on the fourth day(104 448.46±13 314.1 pg/ml) and then declined quickly after 5 to 6 days;il5 appeared on the first day and reached a peak(135.125±46.75 pg/ml);il6 appeared on the first day with a peak on the 48 h(55.823±44.639 pg/ml).②the dynamic levels of il4 and ifnγ in the plasma of balb/c mice infected with den2 ngc strain were levels of il4 were significantly increasing after den2 infection while that of ifnγ were lower:il4 reached a peak on the first day(4 294.668±349.038 pg/ml) and then the levels of ifnγ higher on the forth and eleventh day. (2)the concentrations of cytokines produced by infected animals had been closely associated with the doses of sion:both th1 and th2 responses are induced by den2 and play a role;while,th2 response is more predominant than th1 cell and threlated cytokines are importance with den infective diseases.

　　［key words］ dengue virus type 2；th1；th2；cytokines

　　登革病毒(dengue virus, den)是由白纹伊蚊及埃及伊蚊传播的黄病毒属(flaviviridae)的成员。有4种典型的血清型［1］。登革病毒感染人类最常见的是无明显症状的急性自限性发热性疾病登革热(dengue fever, df)，还可引起严重的威胁生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever, dhf)和登革休克综合症(dengue shock syndrome, dss)，其中以2型den感染最为常见［2］。近年来den感染在全球许多地方卷土重来，并且流行区域正在逐渐扩大，已成为世界上分布范围较广、发病率较高、危害性较大的疾病，引起国际医学界的高度重视。

　　dhf/dss的发病机制，一直是医学研究的热点，国内外研究提示den感染诱导免疫细胞产生的细胞因子与其致病机理密切相关［3］。为了研究den感染的致病机制，本课题通过建立balb/c小鼠感染模型，观察2型den ngc株初次感染和再次感染balb/c小鼠后，小鼠血浆中th1和th2类主要细胞因子产生水平及其动态变化，研究den ngc株感染的免疫机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 毒株和细胞株 登革2型病毒ngc株（new guinea c strain）（鼠脑保存）购自中国预防医学科学院流行病所。恒河猴肾传代细胞（cv1）购自安徽医学科学研究所。以上病毒和细胞株由本室常规传代和液氮保存。

　　1.2 动物 清洁级balb/c小鼠140只，6～8周龄，18～20 g/只，雌雄各半。购自云南省实验动物中心，质量合格书no.0001404。

　　1.3 主要试剂 ifnγ（编号cg50711ca）、il2（编号c45293ca）、il4（编号cg49730c）、il5（编号c148566c）、il6（编号cf48701c）、il10（编号ch51118c） elisa原装试剂盒，endogen公司产品，购自深圳晶美生物工程有限公司；tgfβelisa kit（编号0404wk），lifekey公司原装进口。

　　1.4 动物的感染 将140只小鼠分为4组（每组35只，为避免过分拥挤，每组分为7笼，雌雄分笼饲养），同时设正常对照组。实验时间为秋冬季，将动物饲养于防蚊措施良好的特定房间，防止蚊虫叮咬。根据病毒tcid50滴定结果，分别用102、103、104、105 tcid50四个剂量den2临床株（分别以n1、n2、n3、n4组表示）以皮下多点注射感染动物，每组35只，连续3天，每天0.5 ml/只。于初次感染后第16天用100 tcid50的ngc株以相同途径再次感染动物，注射1次；正常对照组用稀释液（hank’s液）同法注射。

　　1.5 标本采集

　　1.5.1 病毒分离及特异性抗体检测的标本收集 无菌操作采集各组初次、再次感染后第1周内鼠尾静脉edta抗凝血，分离血浆，用cv1细胞常规进行病毒分离，用间接免疫荧光法鉴定病毒。同时采集初次感染后第4、6、8、10、12、15天和再次感染后第1、2、4、8、11、18、25、31、38、45天各组鼠尾静脉血，分离血浆，用于检测特异性igg、igm类抗体。

　　1.5.2 分别采集初次感染后第4、6、8、12、15天和第17、18、20、24、27、34天（即再次感染后第1、2、4、8、11、18天）各组每只实验小鼠尾静脉抗凝血，将同组小鼠血混合，用无菌pbs分别10倍稀释各组抗凝全血，4℃、5 000 r/min离心10分钟。取各组血浆小管分装，用于细胞因子检测，-30℃冻存，1个月内使用。

　　1.6 检测方法

　　1.6.1 病毒分离及特异性抗体的检测 将采集标本分离血浆，cv1细胞常规进行病毒分离，间接免疫荧光法鉴定病毒。同时将采集标本用间接elisa法检测抗den特异性igg、igm类抗体。

　　1.6.2 细胞因子的检测 用双抗体夹心elisa法分别检测感染后不同时间il4、ifnγ、il5、il6、il10、il2和tgfβ的浓度。按说明书操作。

　　1.7 统计学处理 根据标准曲线通过od值计算细胞因子浓度（pg/ml），用方差分析、t检验等进行统计学处理。统计学处理用microsoft excel 2000和spss 10.0完成。

　　2 结果

　　2.1 病毒分离及特异性抗体的检测 初次和再次感染后小鼠无死亡，能从感染小鼠外周血血浆中分离到den2并能诱导抗den2特异性igm、igg抗体产生［4］。

　　2.2 细胞因子的检测

　　2.2.1 il2的动态变化 在初次感染阶段，ngc株各剂量感染组于第4天产生il2但水平较低,维持到第6～8天后逐渐下降，四个剂量组产生il2动态相似。

　　再次感染第1天各感染组小鼠产生il2迅速升高，于第4天左右达到高峰，维持5～7天后迅速下降。正常对照组il2维持在相对较低水平，各感染组与正常对照组存在显著性差异(p＜0.05)。用den2 ngc株病毒感染实验小鼠后产生il2的水平及动态见图1。

　　2.2.2 il4的动态变化 在初次感染阶段，ngc株各感染组产生il4较早，于第4天已产生。在再次感染阶段，各感染组于第1～2天il4水平即达高峰，见图2。正常对照组il4维持在相对较低水平，各感染组与正常对照组存在显著性差异(p＜0.05)。

　　2.2.3 ifnγ的动态变化 ngc株初次感染balb/c小鼠后，不同剂量病毒感染小鼠产生ifnγ时间有差异，n4组产生最早（第4天）；n1组出现最晚（第12天），见图3。再次感染后，各组小鼠产生ifnγ水平于第1～4天内上升并达到高峰。

　　正常对照组ifnγ水平在初次感染早期高于各感染组。在再次感染后期较n4组高。

　　2.2.4 il5的动态变化 各组实验小鼠于初次感染后第6天开始产生il5，并于第12～15天达到高峰，而后逐渐下降。在再次感染阶段，各组于第1天il5水平开始升高，于第1～2天达高峰。在初、再次感染阶段，ngc株各感染组产生il5的水平，各组之间有显著差异(p＜0.05)；各感染组与正常对照组存在显著性差异(p＜0.05)。ngc株感染各组后产生il5的水平及动态见图4。

　　图1 ngc株再次感染后balb/c小鼠血浆中il2的动态（略）

　　fig.1 dynamic curves for levels of il2 in the plasma of balb/c mice after secondary infected with den2 ngc strain

　　note:↑ shown infection time.

　　图2 ngc株初再次感染后balb/c小鼠血浆中il4的动态（略）

　　fig.2 dynamic curves for levels of il4 in the plasma of balb/c mice after primary and secondary infected with den2 ngc strain

　　图3 ngc株初再次感染balb/c小鼠血浆中ifnγ的产生动态（略）

　　fig.3 dynamic curves for levels of ifnγ in the plasma of balb/c mice after primary and secondary infected with den2 ngc strain

　　2.2.5 il6的动态变化 在初次感染阶段，n1组始终未检测出il6，其余各感染实验小鼠产生il6较晚，在感染第8～12天才出现，其中n3和n4组il6水平较高。在再次感染后第1天，各组小鼠迅速产生il6并达高峰，而后逐渐下降，各组小鼠il6产生的动态相似。正常对照组il6维持在相对较低水平，各感染组与正常对照组存在显著性差异(p＜0.05)。ngc株感染后各组小鼠产生il6的水平及动态见图5。

　　图4 ngc株初再次感染后balb/c小鼠血浆中il5的动态（略）

　　fig.4 dynamic curves for levels of il5 in the plasma of balb/c mice after primary and secondary infected with den2 ngc strain

　　图5 ngc株初再次感染后balb/c小鼠血浆中il6的动态（略）

　　fig.5 dynamic curves for levels of il6 in the plasma of balb/c mice after primary and secondary infected with dv2 ngc strain

　　图6 ngc株初再次感染后balb/c小鼠血浆中il10的动态（略）

　　fig.6 dynamic curves for levels of il10 in the plasma of balb/c mice after primary and secondary infected with den2 ngc strain

　　2.2.6 il10的动态变化 在初、再次感染阶段，各感染实验组产生il10的时间相差较大。n3在整个感染阶段，只在初次感染末期出现一个小峰，然后在再次感染初期继续下降消失。各感染组与正常对照组存在显著性差异(p＜0.05)。ngc株感染各组后产生il10的水平及动态见图6。

　　2.2.7 tgfβ的动态变化 在初次感染阶段除n3外，各感染实验组于8～12天产生tgfβ达高峰。n3在整个感染阶段，只在再次感染末期出现一个小峰，见图7。

　　图7 ngc株初再次感染后balb/c小鼠血浆中tgfβ的动态（略）

　　fig.7 dynamic curves for levels of tgfβ in the plasma of balb/c mice after primary and secondary infected with dv2 ngc strain

　　note:↑ shows infection time.

　　3 讨论

　　登革病毒感染所致疾病的发病机制至今仍未完全阐明。虽然细胞因子在登革病毒的致病过程中的重要作用已得到普遍认同，但各种细胞因子在den感染过程中的具体作用以及其对th1和th2应答优势之间转化的调节机制尚未完全明了。研究显示，抗原刺激后th0细胞选择性地向th1或th2细胞的分化受多种因素的影响，如抗原递呈水平产生细胞因子的微环境、抗原的性质种类及剂量、抗原提呈细胞及其他一些mrna水平的调控影响［5］。病毒作为抗原由于其数量、质量、分布范围、存在的部位等方面都可以不断地发生变化，决定了其诱发的免疫应答表现为多重应答和应答的持久性。

　　有研究表明，den感染后病情较轻时机体往往以th1应答优势为主，而病情较重时则主要是th2应答优势；登革热患者体内th1应答占优势，在登革出血热患者则转化为th2应答优势［6］。den2可主动在b细胞中复制，诱导b细胞产生il6［7］。il6的水平上升与dhf/dss患者的血液浓缩、浆液渗漏和腹水等临床症状有关，导致严重性den2感染性疾病。且il6在再次感染抑制th1细胞的分化，并在启动th2细胞分化中起十分重要的作用，可加重疾病的发展。本研究结果显示在初次感染阶段即产生il4，在以相同剂量(100 tcid50/0.5 ml)再次感染后，在第17、18天il4上升到高峰时ifnγ处于最低水平，而当第20天il4下降后ifnγ开始上升，并迅速达到峰值。提示登革病毒感染小鼠后，可引起th2应答优势，产生il4、il5、il6等细胞因子。各感染组中，n4和n3组产生il4、il6的水平较高，并与其他感染组存在显著差异(p＜0.05) 。

　　结果提示病毒抗原进入机体，刺激机体发生免疫应答。随着疾病的发展，il4水平处于高峰，抑制th1应答，表现为th2应答优势。可能由于初次感染阶段后期，病毒进入靶细胞，如单核细胞、kupffer细胞等，引起一定水平的细胞免疫，表现为ifnγ水平上升，同时对th2应答起抑制作用，使病情有一定好转。在再次感染阶段早期，记忆性体液免疫对进入机体的病毒，迅速发挥作用；在再次感染阶段中期，细胞免疫发挥一定作用，抑制th2应答，特异性ctl可通过溶解感染细胞来清除den，使病情好转；再次感染阶段后期，可能是den2感染的靶细胞被溶解破坏，释放小剂量病毒，引起的一定程度的体液免疫和细胞免疫应答。

　　tgfβ对于不同的靶细胞具有多种免疫调节作用。在不同浓度下，tgfβ可能发挥促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的作用。tgfβ可抑制th1类细胞因子产生，而促进il10等th2细胞因子产生。对于登革病毒感染性疾病，tgfβ与病情严重程度及疾病持续时间均有关系。病情持续9天以上的dhf ⅳ级患者体内tgfβ水平最高。通过对血清中tgfβ1和il12水平检测后发现，两者在df和各级dhf中呈反相关［7］。高浓度的tgfβ可能抑制炎性细胞因子il6的产生，中低浓度则促炎性细胞因子的产生。各n1、n2、n3组在再次感染阶段第27天ifnγ水平处于高峰，第28天tgfβ再次升高后ifnγ水平迅速下降，提示tgfβ可抑制ifnγ的产生。

　　本研究证明在den2 ngc株引起的登革病毒感染小鼠模型中，体液免疫和细胞免疫均发挥了一定作用并相互影响。th细胞和其ck在den感染疾病的发病机制中起重要作用。

【参考文献】
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