【摘要】 以酸性药物萘普生、布洛芬、双氯芬酸、苯丙氨酸和2，4-二氯苯氧基乙酸为研究对象，探讨了酸性药物在微乳液相色谱体系中保留机理，建立了酸性药物的容量因子(k′)与表面活性剂浓度、助表面活性剂浓度、亲脂性有机溶剂浓度以及流动相ph值之间的相关模型。结果表明，表面活性剂、助表面活性剂和亲脂性有机溶剂的浓度以及流动相ph值的变化对酸性药物的容量因子的影响完全与理论模型相吻合。所建立的保留模型能较好地反映在微乳液相色谱体系中微乳液组成和ph值对酸性药物保留行为的影响。
【关键词】 微乳液相色谱；保留模型；保留行为；萘普生；布洛芬；双氯芬酸；苯丙氨酸；2，4-二氯苯氧基乙酸
retention behavior of acid drugs in microemulsion liquid chromatographyshi jie-hua*，，li ting，zhou xiao-hui(college of pharmaceutical sciences，state key laboratory breeding base of green chemistry synthesis technology，zhejiang university of technology，hangzhou 310032)abstract the retention mechanism of acid drugs such as naproxen，ibuprofen，diclofenac，phenylalanine and 2，4-dichlorophenoxy acetic acid in microemulsion liquid chromatography has been retention modeling between capacity factors (k′) of acid drugs in microemulsion liquid chromatography and concentration of surfactant，cosurfactant and lipophilic organic solvent and ph value was results showed the effect of change of concentration of surfactant，cosurfactant and lipophilic organic solvent and ph value on capacity factors of acid drugs in microemulsion liquid chromatography was fully consistent with the theoretical retention modeling can better reflect the effect of composition of microemulsion solution and ph value on retention behavior of acid drugs in microemulsion liquid chromatography.
keywords microemulsion liquid chromatography；retention modeling；retention behavior；naproxen；ibuprofen；diclofenac；phenylalanine；2，4-dichlorophenoxy acetic acid
1 引言
微乳液由表面活性剂、助表面活性剂(醇)、亲脂性有机溶剂(油)及水组成的，粒径为纳米级的液滴(分散相)分散到另一种不相混溶的液体(连续相)中所形成的胶体分散系统。微乳液相色谱(melc)是以微乳液为流动相的高效液相色谱系统[1～3]。melc与传统高效液相色谱(hplc)相比具有独特的选择性及高效性，已经受到了越来越多的关注[4～12]。本实验研究了在十二烷基硫酸钠（sds）-异丁醇-异辛烷-磷酸盐缓冲溶液构成的o/w微乳液作为流动相的微乳色谱体系中，微乳组成的变化对酸性药物萘普生、布洛芬、双氯芬酸、苯丙氨酸、2，4-二氯苯氧基乙酸(见表1)的保留行为的影响；以溶质在三相中的平衡为依据，建立微乳色谱体系中酸性药物的保留模型，为微乳液相色谱的发展提供理论基础。
表1 酸性药物的分子结构及醇-水分配系数(logp)（略）
table 1 molecular structures and octanol-water partition coefficients (logp) of acidic drugs
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
alliance 2695 型高效液相色谱仪和2996型二极管阵列检测器(美国waters公司)，empower化学工作站(美国waters公司)；zy1104型c18液相色谱柱(100 mm×4.6 mm，10 μm， 北京分析仪器厂)；电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。
萘普生、布洛芬、双氯芬酸、l-苯丙氨酸、2，4-二氯苯氧基乙酸(浙江工业大学药学院药物分析实验室提供)；十二烷基硫酸钠(化学纯，广西汕头市西陇化工厂)；异丁醇(分析纯，上海化学试剂采购供应联化工厂)；异辛烷(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，上海陆都试剂有限公司)；ｋｈ２ｐｏ４和ｋ２ｈｐｏ４(分析纯，浙江湖州化学试剂厂)；ｈ3ｐｏ４(分析纯，浙江新安化工集团股份有限公司)。
2.2 拟三相图制作
助表面活性剂(异丁醇)/表面活性剂(sds)按一定质量比混合，然后表面活性剂混合液与油(异辛烷)的质量比分别为10∶0，9.8∶0.2，9.5∶0.5，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9混合，搅拌均匀，各混合液在25℃下滴加水或磷酸盐缓冲溶液。依据相变和溶液电导率的变化制作拟三相图。
2.3 样品溶液和流动相的配制
分别称取适量的萘普生、布洛芬、双氯芬酸、苯丙氨酸、2，4-二氯苯氧基乙酸置于10 ml容量瓶中，用微乳液溶解并稀释至刻度，配制成1 g/l的样品溶液， 使用前经0.22 μm纤维素膜过滤。
称取适量sds置于500 ml容量瓶，加入25 mmol/l kh2po4(或k2hpo4)溶液，超声至sds溶解，再加入适量的异丁醇和异辛烷，并用25 mmol/l kh2po4(或k2hpo4)稀释至刻度，超声处理2 min后，用稀h3po4调节至所需ph值。使用前用0.45 μm 微孔滤膜真空过滤。
３ 结果与讨论
3.1 o/w微乳液区域的确定
微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发形成的无色透明、各向同性、低粘度的热力学稳定体系。当组成比例不同时，微乳液结构也不相同。为了获取稳定的o/w微乳液，通过拟三相图的制作确定o/w微乳液区域，如图1所示。
从图1可知，随着sds-异丁醇-异辛烷-磷酸盐缓冲溶液的比例的改变，微乳结构发生明显变化。在微乳区中，归属于稳定的o/w微乳区域较小，且该区域的大小随着异丁醇/sds比例的增大略有缩小。另外，水相中离子强度和ph值的大小，对稳定的o/w微乳区域的影响较小。当异丁醇∶sds＜3∶1，(异丁醇+sds)∶异辛烷＞3∶1，磷酸盐缓冲溶液∶(异丁醇+sds)＞2.1∶1时，可获得较稳定的o/w微乳液。
3.2 溶质的保留模型的探讨
微乳液是一种亲脂性有机溶剂(油)修饰的胶束溶液，亲脂性有机溶剂分散在胶束相内，形成微乳液滴。因此溶质在微乳色谱体系中的保留模型可以按亲脂性有机溶剂修饰的胶束色谱(mlc)体系进行处理。目前，普遍认为溶质在胶束液相色谱(mlc)中的保留主要取决于溶质在水相、胶束相和修饰后固定相三相之间的平衡[14](见图2)。
图1 sds-异丁醇-异辛烷-磷酸盐缓冲溶液体系的相图（略）
fig.1 phase diagrams of sodium dodecyl sulfate(sds)-isobutanol-isooctane-phosphate buffer solution systems
a． 乳浊区(emulsion)；b． 液晶区(liquid crystal region)；c． w/o微乳区(w/o microemulsion)；d． 共存区(coexistence region)；e． o/w微乳区(o/w microemulsion)；f． 多相区(multi phase)。
图2 溶质在melc中三相间的平衡示意图（略）
fig.2 solute equilibria among bulk solvent，microemulsion droplet and surfactant-modified stationary phase in melc
：sds； ：异丁醇(isobutanol)； s：溶质分子(solute molecule)。
假定在所考察的微乳组成范围内，微乳组成的变化及溶质不影响表面活性剂(sds)的临界胶束浓度(cmc)；在所考察的助表面活性剂(异丁醇)及表面活性剂(sds)浓度范围内，sds对固定相的结合修饰达到饱和的稳定状态；亲脂性有机溶剂(异辛烷)只存在于微乳液滴相内部。则根据armstrong等[14]提出的在胶束液相色谱体系中，溶质的保留和选择性主要取决于溶质在水相、胶束相和固定相之间的三相分配平衡。对于酸性溶质分子在微乳液相色谱体系中存在着下列分配平衡关系：（1）酸性溶质(ha)在水相中的电离平衡；（2）ha和a-在水相与微乳液滴(m)间的分配平衡；（3）ha和a-在水相与修饰的固定相(s)之间的分配平衡；（4）微乳液滴(m)相中的ha和a-与修饰的固定相之间的分配平衡。对于酸性药物溶质的分子(ha)而言，在微乳液相色谱体系中的容量因子(k′)可定义为：
k′＝β［ａｓ］＋［ｈａｓ］ ［ａ-］＋［ｈａ］＋［ａｍ］＋［ｈａｍ］（１）
依据溶质在三相间的平衡关系，式（1）可描述为：
k′＝βｋφａｓ＋ｋφｈａｓ ｋa［h＋］
１＋１ ｋa［ｈ＋］＋ｋφ，δａｍ［ｍ］＋ｋφ，βｈａｍ ｋa［ｈ＋］［ｍ］（２）
式中，[h＋]为流动相中ｈ＋的浓度，ka为溶质的电离常数。[as]和[a-]分别为以去质子溶质形式存在于修饰固定相和水相中的浓度；[has]和[ha]分别为溶质存在于修饰固定相和水相中的浓度；[am]和[ham]分别为在微乳液滴相中去质子溶质和溶质的浓度；[m]为表面活性浓度；β为相比(固定相体积与流动相体积之比)。 κφａｓ和ｋφｈａｓ表示溶质a-和ha在水相与固定相间的分配常数，该常数的大小受微乳色谱体系中助表面活性剂的数量(φ)影响； ｋφ，δａｍ和 ｋφ，δｈａｍ为溶质a-和ha在水相与微乳液滴相间的分配常数，该常数受微乳色谱体系中助表面活性剂的数量(φ)和微乳液滴中的亲脂性有机溶剂数量(δ)影响。
根据文献[15，16]提出的表面活性剂、助表面活性剂(醇)浓度对溶质在胶束液相色谱体系中的保留模型。在微乳色谱体系中，表面活性剂、助表面活性剂(醇)以及亲脂性溶剂(油)的浓度对酸性溶质的保留模型可描述为：
k′=β·ｋａｓ１ １＋ｋａｄφ＋ｋｈａｓ ｋa（１＋ｋｈａｄφ）［ｈ＋］ １＋１ ｋa[h＋]+kam1+kamdφ＋κamodδ １＋ｋａｄφ［ｍ］＋ｋｈａｍ(1+khamdφ＋ｋｈａｍoｄδ) κa(1+khadφ)［η＋］［μ］（3）
式中，kas和khas表示纯胶束体系中溶质a-和ha在水相与固定相间的分配常数；kam和 kham为纯胶束体系中溶质a-和ha在水相与胶束相之间的分配常数。kasd， khasd， kad， khad， kamd， khamd和kasd分别为助表面活性剂对分配系数影响的修正系数， kamod和khamod分别是微乳液滴中的亲脂性有机溶剂对分配系数影响的修正系数。
3.3 表面活性剂浓度对溶质保留行为的影响
由式（3）可知，当微乳色谱体系中助表面活性剂浓度、亲脂性有机溶剂的浓度和流动相ph值一定时，酸性溶质的容量因子(k′)与表面活性剂浓度([m])间的关系可描述为：
１/k′=a＋b[m](4)
也就是说，在一定的助表面活性剂浓度、亲脂性有机溶剂的浓度和ph值条件下，酸性溶质的容量因子的倒数(1/k′)与表面活性剂浓度([m])呈正比。实验结果表明，酸性溶质的容量因子的倒数(1/k′)与表面活性剂浓度([m])之间具有良好的线性关系，见表2。这表明了所建立的保留模型式（3）或式（4）能较好地反映流动相中表面活性剂浓度对酸性药物在微乳色谱体系中保留行为的影响。
3.4 ｈ＋浓度对溶质保留行为的影响
当微乳色谱体系中sds、助表面活性剂和亲脂性有机溶剂浓度一定时，酸性药物的保留模型(式（3）)可简化为：k′＝(b′+c′[h＋])/(1+a′[h＋])(5)
式中，a′，b′和c′分别是与溶质在三相分配系数相关的常数。实验结果表明，酸性药物的容量因子(k′)与流动相中[h＋]之间能较好地符合的酸性药物在微乳色谱体系中保留模型式（3）或式（5)，如表3所示。这表明了建立的酸性药物在微乳液相色谱体系中的保留模型式（3）或式（5)能较好地反映了流动相中ｈ＋或ph值对酸性药物在微乳色谱体系中保留行为的影响。
表2 容量因子与sds浓度间的相关性（略）
table 2 relationships between capacity factor and concentration of sds
* zy1104 c18 column；流动相(mobile phases)：0.0884~0.2063 mol/l sds，1.01 mol/l 异丁醇(isobutanol)，65.7 mmol/l 异辛烷(isooctane)，25 mmol/l 磷酸盐(phosphates)，ph=3.0；流速(ｆlow rate)：1.0 ml/min；柱温(column temperature)：30 ℃。
表3 容量因子与氢离子浓度之间的相关性（略）
table 3 relationships between capacity factor and concentration of hydrogen ion
流动相(mobile phases)：0.1474 mol/l sds，1.01 mol/l 异丁醇(isobutanol)，65.7 mmol/l 异辛烷(isooctane)，25 mmol/l 磷酸盐(phosphates)；其它条件同表2（the other conditions are the same as in table 2）。
实验表明，当流动相ph值小于酸性药物的水相中的pka值时，其容量因子基本不变；当ph值大于酸性药物的pka值时，随着流动相ph值的增加，其容量因子随之减小。这是由于流动相ph值小于pka值，酸性药物主要以游离酸形式存在； 当流动相ph值大于pka值，部分酸电离形成负离子，使其疏水性减弱，同时，sds修饰的固定相表面带负电荷，带负电荷的溶质与sds修饰的固定相之间的静电斥力使酸性药物的容量因子减小。当ph值增大到一定值后，酸性药物完全电离，容量因子又逐渐趋于平稳。
martin等[17]指出，在hplc体系中化合物的容量因子对数(logk′)与其相应的logp间具有线性相关性。实验结果表明，酸性药物的容量因子对数(logk′)与其相应的logp间无相关性。这是由于酸性药物的保留不仅取决于疏水作用还与其离子化程度密切相关。经多元线性分析发现，在微乳色谱体系中酸性药物的logk′与logp、ka和氢离子浓度[h＋]间具有较好的线性关系，其线性回归方程为：logk=0.0831logp+0.906ka-0.517[h＋]+1.001 (r=0.908，sd=0.60)（6）
回归方程中系数绝对值越大，相应的参数对容量因子的影响越大。通过式(6)中3个参数的系数绝对值大小比较可知，影响酸性药物容量因子大小的次序为： ka＞[h]＞logp。
3.5 助表面活性剂浓度对溶质保留行为的影响
当ph值一定时，将酸性药物的游离态和离子态视为整体溶质，那么保留模型式(3)可改写为：
k′=β·ｋ′ａｓ１ １＋ｋ′ａｄφ １＋k′am１＋ｋ′ａｍdφ+k′amｏdδ 1+k′adφ［μ］(7)
式中，ｋ′ａｓ和ｋ′ａｍ分别为溶质在水相与固定相间的表观分配常数； ｋ′ａｄ和ｋ′ａｍｄ为助表面活性剂对表观分配系数影响的修正系数， ｋ′ａｍｏｄ为亲脂性溶剂对表观分配系数影响的修正系数。
从式(7)可知，当亲脂性溶剂异辛烷、sds浓度一定时，溶质的容量因子倒数(1/k′)与助表面活性剂浓度(φ)成正比，即随着微乳流动相中助表面活性剂浓度的增大，溶质的容量因子随之减小。实验结果证实了酸性药物在微乳色谱体系中的容量因子倒数(1/k′)与流动相中助表面活性剂异丁醇的浓度呈正比，且两者间具有良好的线性关系，如表4所示。这说明了酸性药物在微乳色谱体系中的保留模型式（3）和式（6)能较好地反映流动相中助表面活性剂浓度对酸性药物在微乳色谱体系中的保留行为的影响。
表4 容量因子与助表面活性剂异丁醇浓度之间的相关性（略）
table 4 relationships between capacity factor and concentration of isobutanol as cosurfactant
流动相(mobile phases)：0.1474 mol/l sds，0.675~1.52 mol/l 异丁醇(isobutanol)，65.7 mmol/l 异辛烷(isooctane)，25 mmol/l 磷酸盐(phosphates)；其它条件同表2（the other conditions are the same as in table 2）。
3.6 亲脂性有机溶剂浓度对溶质保留行为的影响
实验结果表明，当微乳体系中sds浓度、异丁醇浓度和ph值一定时，酸性药物容量因子随微乳液中亲脂性溶剂异辛烷的量增加而减小，而且酸性药物容量因子倒数(1/k′)与亲脂性溶剂异辛烷的浓度间呈现良好线性关系，如表5所示。这是由于微乳体系中亲脂性溶剂异辛烷浓度增加，即微乳液滴中亲脂性溶剂异辛烷浓度增加，使疏水性物质在流动相中的溶解度增大，导致其在固定相上的保留能力下降，容量因子减小。该结果与其保留模型式(3)和式(6)完全一致，这意味着保留模型式(3)和式(6)完全能够反映亲脂性溶剂异辛烷浓度对酸性药物在微乳色谱体系中的保留行为的影响。
表5 容量因子与异辛烷浓度之间的相关性（略）
table 5 relationships between capacity factor and concentration of isooctane
流动相(mobile phases)：0.1474 mol/l sds，1.35 mol/l异丁醇(isobutanol)，21.9~131.3 mmol/l 异辛烷(isooctane)，25 mmol/l 磷酸盐(phosphates)；其它条件同表2（the other conditions are the same as in table 2）。
3.7 柱温对溶质保留行为的影响
在色谱法分离过程中，溶质的容量因子(k′)与柱温的相关性可用van′t hoff 方程表示：
lnk′＝-δｈ／ｒｔ＋δｓ／ｒ＋lnβ(8)
式中k′为溶质的容量因子，δh和δs分别为保留过程中溶质的焓变和熵变，r为气体常数，t为柱温(k)，β为相比(固定相体积与流动相体积之比)。以lnk′为纵坐标，1/t为横坐标作图，得到vant′t hoff曲线，其回归方程如表6所示。从表6可知，酸性药物的lnk′与1/t之间具有良好的线性关系。线性vant′t hoff 曲线表明， 在所考察的温度范围内， 酸性药物在微乳色谱体系中的保留机理不随柱温的变化而改变，即分配过程中的δh和δs不受温度的影响。从直线斜率可以求得酸性药物在微乳色谱体系中溶质从流动相分配到固定相过程中的焓变值，在所考察的温度范围内焓变值(δh)均为负值，这说明溶质从流动相(微乳液)分配到固定相是一个放热过程。
表6 酸性药物在微乳液相色谱体系中lnk′与t的相关性（略）
table 6 relationship between lnk′ of acidic drug in microemulsion liquid chromatography and t
流动相(mobile phases)：0.1474 mol/l sds，1.35 mol/l异丁醇(isobutanol)，65.7 mmol/l 异辛烷(isooctane)，25 mmol/l 磷酸盐(phosphates)；其它条件同表2（the other conditions are the same as in table 2）。
3.8 小结
微乳液可视为亲脂性溶剂修饰的胶束溶液。本研究建立了酸性药物在微乳液相色谱体系中的保留模型。结果表明， 所建立的保留模型能较好地反映表面活性剂浓度、助表面活性剂浓度、亲脂性溶剂异辛烷浓度以及ph值对酸性药物在微乳色谱体系中的保留行为的影响。
【参考文献】
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