【关键词】 铜 小脑颗粒神经元 凋亡 磷脂酰肌醇3-激酶
neuroprotective effects of copper against apoptosis induced by low potassium in cultured rat cerebellar granule neurons
lan xiu-jian,ye min-zhong,li ying-ying,liu pei-qing,yu jian-ping, pi rong-biao
ment of pharmacology & toxicology, school of pharmaceutical sciences, 2. basic medical experimental teaching center,sun yat-sen university,guangzhou 510080, china
abstract:【objective】to investigate the effects and mechanism of copper on apoptosis of primary cultured cerebellar granule neurons induced by low potassium. 【methods】 apoptosis was induced by low potassium in cultured rat cerebellar granule neurons. the neuronal viability was measured by mtt. morphology of neurons and their nuclei were observed by phase-contrast microscopy and hoechst 33258 staining, separately. the ratio of apoptotic cells was detected by flow cytometry (fcm). 【results】 appropriate copper (1~40 μmol/l) blocked apoptosis of primary cultured cerebellar granule neurons induced by low potassium. the effects of diminished neuronal body, chromatin concentration and the ratio of apoptotic cells induced by low potassium were markedly weakened by copper. the neuroprotective effect of copper sustained for over 72 h. but the effect can be suppressed by ly294002, a specific inhibitor of pi3-k. 【conclusion】 copper, at appropriate concentration, was found to protect against apoptosis induced by low potassium in primary cultured cerebellar granule neurons and pi3-k/akt signaling pathway might be involved in the copper-mediated anti-apoptotic effects.
key words: copper; cerebellar granule neurons; apoptosis; pi3-k
铜是人体必需的微量元素,正常人血浆铜浓度约为15 μmol/l。微量的铜是细胞色素氧化酶(cytox)、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶等必需的组成部分。现大量研究工作已表明由于环境或基因变化可能会导致铜在体内平衡的破坏并最终导致各种神经退行性疾病(neurodegenerative disease)。已有报道阿尔茨海默病(alzheimer′s disease,ad)、帕金森病(parkinson′s disease,pd)、亨廷顿舞蹈病(hungtington disease,hd)、wilson病和menkes病等都与铜的失衡相关[1-5]。神经退行性疾病多由中枢神经发生了病理性的程序性死亡所致。如由于基因异常导致体内铜缺乏的menkes病[6]患者小脑有颗粒细胞层变薄、神经元细胞减少等特征性变化。yan等[7]发现低钾可诱导小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons, cgns)凋亡:去极化浓度的k+(培养液中含25 mmol/l 的kcl,下简称25k)抑制体外培养cgns的凋亡,低钾(培养液中含5 mmol/l 的kcl,下简称5k)则诱导cgns凋亡,其具有典型的形态学和生化特征:包括细胞核明显固缩、凝聚和断裂。该模型现已成为研究神经元凋亡及其信号转导机制的经典模型之一。研究表明,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinane,pi3-k)及其下游激酶akt-1与神经元存活密切相关,是神经元存活的重要通路[8,9]。微量的铜是否干扰低钾诱导cgns凋亡,以及通过什么机制影响cgns的存活尚未见报道。因此,本文在用低钾诱导体外培养的cgns发生凋亡后,观察微量的铜对cgns凋亡是否具有保护作用并探讨其与pi3-k/ akt通路的关系,为神经退行性疾病中铜的作用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动 物
出生7 ~ 8 d的sd乳鼠,体质量16 ~ 19 g,雌雄兼用。由中山大学实验动物中心提供。
1.2 药 品
basal medium eagle培养基(bme)和胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)均为gibco brl产品。胰酶(trypsin),脱氧核糖核酸酶(dnase),胰酶抑制剂,阿糖胞苷(ara-c),多聚赖氨酸,溴化乙啶(ethidium bromide,eb),hoechst 33258,琼脂糖凝胶等均为sigma公司产品。ly294002购自美国calhiochem公司。dna分子量标准dl2000购自日本takara biotech公司。其余试剂为国产分析纯。
1.3 仪 器
co2 细胞培养箱购于 thermo electron corporation;荧光倒置显微镜购于leica仪器有限公司;dyy-8c型电泳仪购于北京市六一仪器厂,elx-800型酶标仪购于bio-tek公司,yj-875s医用净化工作台购于苏州净化设备公司等等。
1.4 方 法
1.4.1 cgns离体培养
参照yan等 [7]介绍的方法建立原代大鼠cgns培养及凋亡模型。
1.4.2 分 组
将含血清和25 mmol/l kcl的bme培养基换成无血清含25 mmol/l kcl的bme培养基16 h后才开始分组。 ①对照组(control,ct或25 k):不再加药,只同时换无血清含25 mmol/l kcl的bme培养;②低钾模型组(5k):将无血清25 mmol/l kcl的bme培养基换成含5 mmol/l kcl的bme培养基;③ cu2++5k组:加入用含5 mmol/l kcl的培养液稀释cucl2成1、5、10、20、30、40 μmol/l的培养基;④ cu2++25k组:加入用含25 mmol/l kcl的培养液配成20 μmol/l cucl2的培养基;⑤ly+cu2++5k组:加入用含5 mmol/l kcl的培养液中配成20 μmol/l ly294002和20 μmol/l cucl2的培养基;⑥ly+25k组:加入用含25 mmol/l kcl的培养液配成20 μmol/l ly294002的培养基;⑦ly+5k组:加入用含5 mmol/l kcl的培养液配成20 μmol/l ly294002的培养基。
1.4.3 细胞存活率分析
按文献[10]的mtt方法,各因素处理后,按照设定组给药后24 h,加入mtt工作液(终浓度为0.5 mg/ml),继续培养4 h,吸去上清液,加入相应培养基体积的dmso溶液,振荡混匀10 min后,酶标仪检测各孔的570 nm处吸光度值。
1.4.4 相差显微镜观察神经元形态学
按yan等[7]的方法,各因素处理后,按照预定的时间于倒置相差显微镜(leica,×400倍视野)观察并拍照神经元的形态学改变。
1.4.5 hoechst33258核染色进行核形态学分析
按yan[7]等的方法,各因素处理后,用pbs 4 ℃ 洗2 次, 40 g/l多聚甲醛液(4 ℃ ,溶于pbs)固定15 min,移去固定液,用蒸馏水清洗2次,每孔加入5 μg/ml hoechst 33258 室温孵育5 min,用蒸馏水清洗2次,在荧光倒置显微镜下观察细胞核形态学变化并随机拍照(激发波长200 ~ 380 nm,可释放波长420 nm的蓝色荧光)。
1.4.6 细胞dna亚二倍体凋亡峰检测
按文献[11]的方法,各因素处理后,移去培养液,培养24 h后,用2.5 g/l胰蛋白酶消化收集各组细胞,pbs反复洗2次,最后将细胞重悬于700 ml/l的乙醇中,4 ℃固定过夜,加入rnase(1 g/l),37 ℃处理1 h,用碘化丙啶(pi)对样品dna荧光染色,然后上流式细胞仪检测各组细胞的dna亚二倍体凋亡峰。
1.4.7 统计学分析
所有实验用不同批次的神经元重复3次。计量数据以 x ± s表示,采用统计软件spss 11.0进行数据处理,不同组间神经元存活率分析采用方差分析(anova)检验,有显著意义后用最小有意义差异t检验(least significant difference-t test,lsd-t)进行均数间的多重比较,检验水准α=0.05。
2 结 果
2. 1 铜抗低钾诱导cgns凋亡的的浓度范围
低钾作用cgns 24 h后,低钾模型组神经元生存率急剧下降65.4% ± 1.9%,与对照组(100%)生存率比较,p < 0.001;不同浓度(1、5、10、20、30、40 μmol/l)的cu2++5k组,神经元生存率都有上升,分别为:72.6% ± 1.8%、77.3% ± 1.6%、79.6% ± 2.1%、82.8% ± 2.4%、81.9% ± 1.7%和77.0% ± 1.5%,各浓度与低钾模型组相比,p < 0.001;不同浓度(10、20、30 μmol/l)的cu2++5k组之间无显著性差异(p > 0.05),但与1、5、40 μmol/l的cu2++5k组有显著性差异(p < 0.05)。经spss软件分析,各组数据服从正态分布及具方差齐性(总f =42.48,p < 0.001,n=6)。因此,以5 ~ 30 μmol/l浓度范围的微量cu2+抗凋亡的效果最好,以后实验中我们选用20 μmol/l的铜的浓度作为其对低钾诱导cgns凋亡保护作用的有效浓度。
2.2 相差显微镜及hoechst染色观察
相差显微镜下观察对照组cgns胞体饱满透亮,细胞突起以及由之构成的网络紧密、清晰而完整(图1a)。在低钾模型组中触发cgns凋亡,神经元大部分胞体出现皱缩,胞体明显缩小,神经元突起及网络出现紊乱,轴突及树突断裂或消失(图1b)。而在20 μmol/l cu2+与低钾共同作用cgns组,大部分神经元都能保持胞体和突起的完整(图1c)。hoechst33258染色的方法在荧光显微镜下观察可见正常细胞核体积较大,较圆,表面光滑,细胞核发出弥散均匀蓝色荧光(图1a); 低钾模型组可见大部分胞核体积明显变小,皱缩,呈浓染致密的颗粒块状,有时可见核碎裂成小叶状的凋亡细胞核(图1b);20 μmol/l cu2+与低钾共同作用cgns组的凋亡细胞核形态和凋亡小体明显减少(图1c)。
2.3 fcm检测凋亡峰
流式细胞仪检测凋亡峰(图2)中,正常对照组cgns的凋亡率较少,约为1.5%;低钾模型组凋亡率很高,约为70%;而加20 μmol/l cu2+组凋亡率明显减少,约为30%。由此可观察到铜对低钾诱导cgns凋亡的保护作用。
2.4 铜抗低钾诱导cgns凋亡作用的时效性
低钾作用cgns后,培养24 h、48 h、72 h时神经元存活率随着作用的时间不断延长而下降,分别为70.6% ± 1.4%、60.3% ± 1.2%、57.1% ± 1.7%;而20 μmol/l cu2+与低钾共同作用组的生存率明显高于低钾模型组,分别为90.8% ± 1.8%、72.6% ± 1.2%、68.5% ± 2.4%,不同时间点上,两组比较p <0.001,经spss软件分析,各组数据服从正态分布及具方差齐性(总f =188.07,p=0.000,n=6)。
2.5 观察ly294002对铜抗低钾诱导cgns凋亡的作用
pi3k/akt通路是介导存活的一条经典通路,ly294002为akt上游激酶pi3-k的特异抑制剂,可以抑制akt的磷酸化进而阻断该通路的信号转导。ly294002对铜抗低钾诱导cgns凋亡的作用结果见图3。由图3可知,ly+cu2++5k组作用24 h后,与cu2++5k组比,使神经元存活率大大下降,提示ly294002可逆转微量铜抗低钾诱导的cgns凋亡的作用。
3 讨 论
3.1 铜的神经保护作用
神经退行性疾病多由中枢神经发生了病理性的程序性死亡所致,它是神经系统正常发育的必经之路,而成熟的神经元不能再生增殖,因而,如何减少因病理性凋亡而损失的神经元显得尤其重要。铜是人体必需的金属离子,是体内氧化还原酶和单氧化酶类的辅助因子,存在于细胞色素c氧化酶、多巴胺-β-羟化酶、超氧化物歧化酶、酞-α-酰胺酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶和铜蓝蛋白等蛋白质中,铜在这些酶类的氧化代谢中起重要作用。体内铜代谢是否正常,关系到多脏器正常生理运转功能,尤其神经系统,其一旦损害则恢复较为困难。铜在体内的失衡与神经退行性疾病密切相关,铜的增加或缺失都可导致神经退行性疾病[1-6]。本实验从细胞形态学观察、hocchst33258核染色、fcm观察细胞凋亡峰、存活率等方法等角度进行观察,发现微量的铜能够在一定浓度范围内对低钾所致的cgns凋亡有保护作用,此作用具长时效性。由此进一步证实,微量元素铜在神经退行性疾病具有重要的作用,维持神经系统中铜适量的浓度可抑制神经元凋亡的进程。
3.2 铜神经保护作用的机制
磷脂酰肌醇3-激酶/akt(pi3-k/akt)信号传导通路是促神经元存活通路[12]。本实验中,ly294002可逆转微量铜抗低钾诱导的cgns凋亡的作用,使神经元存活率下降,提示pi3-k/akt信号传导通路可能参与铜的神经保护作用。pi3k/akt 信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡,促进细胞周期进展,从而促进细胞的生存和增殖。通常,维持神经元存活因素作用于神经元后,信号传入细胞内激活pi3-k,进而催化形成磷酰肌醇-3,4-磷酸以激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶akt。akt 主要作用于抗凋亡通路,因为显性负效应 akt 能阻止由类胰岛素生长因子 1(igf1)介导的存活,持续激活 akt 能够阻止由 pten 介导的凋亡。akt 通过对其下游的靶蛋白进行磷酸化而发挥其抗凋亡的作用,如 akt能通过磷酸化 bcl-2 家族成员 bad 和蛋白水解酶 caspase-9 而阻止凋亡;还能磷酸化转录因子 forkhead 家族成员 fkhr,通过抑制 fkhr 的核转位以及 fkhr 的基因靶点 bim 和 fas 配体的激活而抑制凋亡;此外,akt 还能通过对 nf-кb 和 p53的间接作用影响细胞存活,akt 通过磷酸化激活кb 激酶(ikk)导致 nf-кb的抑制剂 iкb 的降解,从而使 nf-кb 从细胞质中释放出来进行核转位,激活其靶基因而促进细胞的存活[13,14]。ly294002为akt上游激酶p13-k的特异抑制剂,可以抑制akt的磷酸化进而阻断该通路的信号转导。去极化浓度的k+促进许多种神经元,包括cgns的存活。高钾的这种“促生存”效应依赖磷脂酰肌醇3-激酶/akt(pi3-k/akt)[15]。但也有研究如dudek等[16]的实验结果不同,他们认为ly294002对在含血清和高钾的培养基中生长的神经元无影响。最近barthel等[17]新报道铜在多种细胞上能激活pi3-k/akt通路。但本实验的结果与barthel的报道相符合,铜的神经保护作用与可能与激活pi3-k/akt信号传导通路有关。
本实验还有一有趣的现象是ly294002不但逆转铜抗低钾诱导cgns凋亡作用,而且可能诱发低剂量的铜对cgns毒性作用。但20 μmol/l ly294002本身对25 mmol/l kcl的无血清培养基中cgns存活率有一定的影响。虽然ly294002对低钾诱导的cgns凋亡影响不大,但与铜共同作用后是否激发其它凋亡机制,这有待进一步研究。
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