【摘要】 建立了固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时检测土壤中氟喹诺酮类、四环素类和磺胺类18种抗生素的分析方法。土样经含50%乙腈的磷酸盐缓冲液(ph=3)提取后，以sax-hlb串联小柱净化富集，在hplc/ms/ms多反应监测模式下进行定性及定量分析。添加浓度为200和50 μg/kg时，土壤中氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类的加标回收率分别为67.2%~89.0%，62.2%~85.4%和55.8%~97.4%；其相对标准偏差为1.1%~17.2%。以3倍信噪比估算出氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类的检出限分别为3.4~8.9 μg/kg，0.56~0.91 μg/kg和0.07~1.85 μg/kg。应用此方法检测6种不同类型土壤样品，结果表明，污灌区土壤中检出有抗生素，浓度为1.72~119.6 μg/kg。
【关键词】 氟喹诺酮；四环素；磺胺；固相萃取；高效液相色谱串联质谱；土壤
simultaneous extraction and determination of eighteen fluoroquinolone，tetracycline and sulfonamide antibiotics from soils using solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry ma li-ｌi，guo chang-sheng，hu wei，sha jian，zhu xing-wang，ruan yue-fei，wang yu-qiu* (key laboratory of pollution processes and environmental criteria of ministry of education，college of environmental science and engineering，nankai university，tianjin 300071)abstract an analytical method was developed for the simultaneous extraction and determination of eighteen fluoroquinolones (fqs)，tetracyclines (tcs) and sulfonamides (sas) antibiotics from soils using solid phase extraction and liquid chromatography tandem mass sample was firstly extracted by phosphate buffer at ph 3 in combination with 50% of organic modifier acetonitrile，then purified and concentrated by sax and hlb ative and quantitative analysis were carried out for the analyte under the mrm mode after the chromatography separation on kromasil c18 (250 mm×4.6 mm，5 μm) range of recoveries (in percent) for fqs，tcs，sas，in the soil matrix was 67.20%-88.98%，62.23%-85.36%，55.76%-97.37% with 1.1%-17.2% of relative standard deviation respectively in two different limits of quantification (loq，s/n=3) were 3.36-8.88 μg/kg，0.56-0.91 μg/kg and 0.07-1.85 μg/kg for fqs，tcs and sas， method was successfully used to detect 18 antibiotics in 6 soil samples with different land types in s showed some of the antibiotics in the arable soil were detected，with concentrations of 1.72-119.57 μg/kg.
keywords fluoroquinolones；tetracyclines；sulfonamides；solid phase extraction；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；soil
1 引言
抗生素广泛应用于人类及动物疾病的防治。据报道，进入动物体内的抗生素有相当一部分随粪、尿等排泄物排出[1]，而粪便、尿液又作为有机肥大量施用于农田，造成抗生素在土壤中不断累积。部分进入污水处理厂的抗生素并不能完全被去除[2~5]，它们又随着终水排放进入环境中。当受污染的水体用于灌溉时，抗生素又从水相转移到土壤相。目前，有关环境中抗生素的分析检测方法的报道较多[6~8]，但同步提取、同时检测土壤基质中多类目标抗生素的高通量快速分析方法尚不完善[9~12]。本实验通过优化前处理及检测条件，建立了同步提取、同时测定土壤中氟喹诺酮、磺胺和四环素类18种抗生素药物的高压液相色谱-串联质谱分析方法，在30 min内完成了18种抗生素的快速分离检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
waters 2695液相色谱仪、quattro microtm api质谱联用仪器、masslynx 4.0工作站(美国waters公司)；十二孔固相萃取装置(美国supelco公司)；氮吹仪(organomation associate)；强阴离子交换柱(sax) sep-pak qmp (3 ml/500 mg，waters公司)；oasis hlb固相萃取柱(6 ml/500 mg， waters公司)；hypersep retain pep 固相萃取柱(6 ml/500 mg，thermo公司)；hypersep c18固相萃取柱(6 ml/500 mg， thermo公司)；proelut c18固相萃取柱(6 ml/500 mg，dikma公司)。
甲醇和乙腈(色谱纯，dikma公司)；超纯水(电阻率≥18.2 mω·cm)；氧氟沙星(torfer gmbh 公司)；诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、四环素、金霉素、土霉素、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异唑、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲基异唑(sigma公司)。其它试剂均为分析纯。
2.2 标准溶液及缓冲液的配制
称取适量四环素类与磺胺类标准品，用甲醇配制成1000 mg/l的标准储备液，称取适量氟喹诺酮类标准品，用甲醇配制成100 mg/l的标准储备液，保存在-20 ℃冰箱中。使用时，以甲醇稀释至所需浓度。配制edta-mcilvaine缓冲液（ph=4）及磷酸盐缓冲液（ph=3）。
2.3 样品前处理
土样采自天津市饮用水源地周边林地0~20 cm的表层土壤(经检测未含目标物)。自然风干后，过０．３０ mm孔径筛，称取2 g放入锥形瓶中，加入适量混合标准溶液后，于室温下暗处放置24 h。
取2 g土样，加0.4 g乙二胺四乙酸二钠及v(磷酸盐缓冲液)∶v(乙腈)=1∶1 (ph=3)的混合液10 ml，振荡20 min， 超声提取10 min，离心并收集上层提取液。反复提取3次后，合并提取液并稀释至400 ml。spe固相萃取柱(sax-hlb串联)预先采用6 ml甲醇、6 ml超纯水、6 ml缓冲液依次淋洗活化。开启真空泵，控制流速约为3~5 ml/min将提取液上柱。过柱完成后，用6 ml超纯水冲洗串联柱，继续抽真空10 min以除去柱中残留水分，拆下sax小柱，将hlb柱于n2保护下干燥10 min。最后，以6 ml甲醇淋洗，收集洗脱液并在室温下用n2吹扫至近干，用甲醇定容至1 ml，待测。
2.4 色谱-质谱条件
kromasil c18色谱柱 (250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流动相为乙腈(a)和0.1%甲酸溶液(b)，柱温25 ℃，流速0.4 ml/min；梯度洗脱程序：0~10 min，15%~30% a；10~16 min，30%~50% a；16~22 min， 50%~55% a；22~29 min，55% a；29~30 min，55%~15% a；30~32 min，15% a。进样量20 μl。
电喷雾离子源；正离子扫描；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；源温度和脱溶剂气温度分别为90和350 ℃；脱溶剂流速和锥孔气流速分别为500和70 l/h；毛细管电压为4 kv。检测方式为mrm模式。锥孔电压、碰撞能及18种抗生素其它质谱条件见表1。
3 结果与讨论
3.1 质谱条件的优化
质谱的锥孔电压、碰撞能对18种抗生素裂解有重要影响。采用流动注射分析法(fia)对目标物单独进样，毛细管电压恒定4 kv，调整锥孔电压，将18种抗生素标准溶液进行全扫描得到最大响应值的母离子， 在ms/ms模式下，调整碰撞能找到该母离子对应的子离子，以mrm模式进行分析（表1）。
表1 多反应监测模式下18种抗生素的质谱分析参数（略）
table 1 ms parameters for 18 antibiotics analysis in mrm transition
3.2 固相萃取柱的选择与串联
土壤中大量天然有机质对hplc检测影响很大。在反相萃取柱前，串联sax柱去除酸性提取液中以阴离子形式存在的腐殖酸类有机质。本实验比较了4种反相萃取柱（proelut c18，hypersep c18， hypersep pep，oasis hlb）对18种抗生素的提取效率。取1 mg/l混合标准溶液400 μl，以400 ml超纯水稀释，作为待测物。由图1可见，proelut c18柱能富集提取出氟喹诺酮类物质，但对磺胺类物质的回收率极低；hypersep c18对磺胺类物质的回收率高于proelut c18， 却不能富集提取出氟喹诺酮类物质。同是硅胶键合c18柱，不同生产商的柱子的回收率存在差异。hypersep pep的吸附剂是一种苯乙烯二乙烯基聚合物，经过键合碳酰胺使它对极性和非极性分析物均有保留，克服了传统的硅胶柱容易干柱的缺点。oasis hlb的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，具有较高的吸附容量。与硅胶相比，oasis吸附剂的表面积增大2~3倍，容量因子提高。总体上，以聚合物为填料的柱子回收率高于硅胶键合c18柱。对于氟喹诺酮类和四环素类物质oasis hlb回收率明显好于hypersep pep柱，同时提取三类抗生素时oasis hlb的效果更好。
图1 4种固相萃取柱的提取效率（略）
fig.1 extraction efficiency of 4 kinds of spe columns on antibiotics
１． proelut c18；２． hypersep c18；３． hypersep pep；４． oasis hlb.
3.3 样品提取液的选择
综合考虑所检测的18种抗生素的pka[10]，参考美国epa推荐方法及相关文献[13~17]，以edta-mcilvaine (ph=4)、含50%甲醇的edta-mcilvaine (ph=4)、加入na2edta的含2%甲酸-乙腈(ph=2.5)、加入na2edta的含50%乙腈的磷酸缓冲液(ph=3)为提取液，提取200 μg/kg的加标土样，含甲醇、乙腈的提取液用超纯水稀释至400 ml后过柱。如图2所示，以edta-mcilvaine (ph=4)提取时，除土霉素外，各物质回收率都小于50%。提取液中加入有机溶剂后提取效率明显改善，使用含50%甲醇的edta-mcilvaine(ph=4)溶液提取时，磺胺类和四环素类的回收率大于50%，多数在70%~90 %之间，但是对氟喹诺酮类的提取效率非常低。含2%甲酸的乙腈溶液对三类抗生素的提取回收率在0~60%之间，且不能有效提取氟喹诺酮类物质。含50%乙腈的磷酸盐缓冲液(ph=3)溶液可以实现3类抗生素物质的同时提取，18种抗生素中回收率在56%~89%之间。
图2 不同提取液对土壤中抗生素的提取效果（略）
fig.2 efficiency of different extractions on antibiotics in soil
１． edta-mcilvaine (ph=4)；２． 含甲醇的edta-mcilvaine (mcilvaine buffer with meoh，1∶1，v/v，ph=4)；３． 含甲酸的乙腈(formic acid in acn， 1∶50，v/v，ph=2.5)；４． 50%乙腈的磷酸盐缓冲液(potassium phosphate buffer with with acn，1∶1，v/v，ph=3)。
3.4 稀释条件对回收率的影响
提取液中含有大量极性有机溶剂，直接进行spe净化，目标抗生素可能会被有机溶剂带出而无法保留在spe柱上，可通过旋转蒸发或用相对弱极性溶剂稀释后降低有机溶剂的浓度提高回收率。文献[17]指出，含50%乙腈的磷酸盐缓冲液(ph=3)用量为15 ml时，稀释至50和100 ml目标物的流失仍然很大。本实验将30 ml含50%乙腈的磷酸盐缓冲液(ph=3)的土壤提取液用超纯水稀释至400 ml后过spe柱，由图3可见， 稀释后的回收率明显提高。
图3 稀释条件对土壤中抗生素提取影响（略）
fig.3 efficiency of dilution on antibiotics in soil
１． 稀释(diluted)；２． 不稀释(undiluted).
3.5 线性范围和检出限
空白土样按照2.3节方法处理后，取适量混合标准溶液定容至1 ml，分别配制成相当于原空白土样中含5，50，100，200，500和1000 μg/kg目标物质的系列混合标准溶液，18种抗生素浓度和峰面积的线性关系很好，相关系数r＞0.99。
3.6 方法的回收率
采用饮用水源地周边不含目标抗生素的土样添加混合标准溶液，在添加水平为200和50 μg/kg时进行回收率实验，结果表明，两个浓度下的平均回收率(n=3)为55.8%~97.4%（表2）。
表2 土壤中18种抗生素的检出限及回收率(n=3) （略）
table 2 detection limits and recovery (n=3) of 18 antibiotics in soil
3.7 土壤环境样品的测定
在天津市饮用水源地周边，天津市北塘排污河及大沽排污河灌溉区各采集2个土样，按本方法检测。饮用水源地周边林地土样中未检出目标物。北塘排污河灌溉地有一个土样检出enr和sia，浓度分别为52.09和2.49 μg/kg，两个土样均检出ofl，浓度分别为23.11和19.23 μg/kg，未检出四环素类物质。大沽排污河灌溉地的一个土样中4种氟喹诺酮类浓度为28.42~119.57 μg/kg，otc和ctc浓度分别为15.61和11.65 μg/kg，7种磺胺类浓度为3.00~8.54 μg/kg。另一土样中ofl和enr浓度分别为15.61和11.65 μg/kg，otc、tc和ctc浓度分别为37.90，45.90和21.89 μg/kg，sia浓度为1.72 μg/kg。可见两个污灌区不同程度受到抗生素污染。
实验结果表明，本方法灵敏度高、检出限低且稳定性好，可以应用于土壤中抗生素含量的分析检测。
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