沉默基因对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响是(细胞凋亡相关基因)

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【摘要】 目的：筛选hmga1基因沉默稳定转染肝癌细胞株，检测沉默后肿瘤细胞凋亡、周期和增殖的变化。方法：靶向hmga1的rnai载体转染肝癌细胞，g418筛选得到稳定转染细胞株并鉴定； mtt法和facs检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果：成功建立基因沉默hmga1稳定细胞株；hmga1基因沉默后，细胞凋亡百分率（29.46±3.04%）明显高于质粒对照组和空白对照组 (1.96±0.76%和2.04±0.70%，p<0.01)；g0g1期细胞百分率（75.21±2.35%）明显高于质粒对照组和空白对照组（37.98±3.02% 和39.23±3.63% ，p<0.01），g2s期（24.79±2.35%）显著低于质粒对照组和空白对照组（62.03±3.01% 和60.77±3.63% ，p<0.01）；mtt检测显示，hmga1沉默细胞增殖与质粒对照组和空白对照组相比显著降低（p<0.01或0.05）。结论：基因沉默hmga1可促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。

【关键词】 rnai hmga1 细胞凋亡 细胞周期

　　effects of hmga1 silence by rna interference on the apoptosis and cell cycle of hepatocarcinoma cells

　　zhu mingguang,zhang xin,yuan hongyan,yang wei,chang yaping.

　　department of immunology, basic medical college of jilin university, changchun 130021,china

　　［abstract］objective:to develop hmga1silencing smmc7721 cell and investigate its impacts on apoptosis and cell cycle in tumor s:constructing hmga1silencing smmc7721 cell through g418 selection of rnai plasmid transfected cells;surveying the apoptosis,prliferation and cell cycle of the tumor cells by facs and s:stable hmga1silencing cells were obtained apoptosis percentage in rnai group（29.46±3.04%） was significantly higher than that in the negative control (1.96±0.76%) or control (2.04±0.70%)within each p<0.001；the cells in g0 g1 phase were 75.21±2.35%,notably higher than in the negative control and control.（37.98±3.02% and 39.23±3.63% respectively，p<0.01），and cells in g2s phase（24.79±2.35%） of hmga1silencing were remarkably fewer than in both the controls（62.03±3.01% and 60.77±3.63% respectively，p<0.01）.mtt detection showed that cell proliferation in rnai group was significantly lower than in both the controls（p<0.01 or 0.05）.conclusion:the silencing of hmga1 by means of eukaryotic expression plasmid can increase the apoptisis of smmc7721 cell, suppress its proliferation and slow its growth.

［key words］ rna interference; hmga1; apoptosis; cell cycle

　　高迁移率族蛋白a1(high mobility group a1, hmga1)是位于细胞核内的小分子非组蛋白，参与细胞多种重要生物学过程，包括基因转录调控、胚胎发生、细胞分化、肿瘤形成和转移等。a在胚胎期表达丰富，而在成熟组织中则表达极少或缺失。但在病理情况下，相当多的恶性肿瘤组织中均发现有hmga1的高水平表达，并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力成正相关[1]。hmga1基因的过强表达是诱发肿瘤的重要因素[2]。rna干扰（rna interference, rnai）是由与靶基因序列同源的双链rna引发的序列特异性基因转录后沉默过程，是目前最为高效特异的基因沉默手段。本研究选择hmga1分子作为干扰靶点，筛选建立基因沉默hmga1稳定转染肿瘤细胞，并检测沉默该基因后对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响，为进一步研究hmga1基因在肿瘤细胞生物学特性及免疫抑制中的作用构建技术平台。

1 材料与方法

　　1.1 细胞培养

　　人肝癌细胞smmc7721(本教研室留存)，在含10%小牛血清的dmem （gibco公司）培养基中370c，5％ co2孵箱(sanyo)培养。按4×105个细胞/ well将细胞铺于6孔培养板,待细胞长至70% 融合时转染。

　　1.2 细胞转染与筛选

　　pu6mrfp质粒由韩国ulsan大学yoon博士惠赠，pu6mrfp sirnahmga1质粒由本室构建[3]。用polyfect将质粒与pcdna3以5：1比例共转染smmc7721细胞，转染方法按qiagen公司试剂盒说明书操作。转染后待细胞生长接近融合时按1：4传代，继续培养细胞至50%～70%融合。弃培养液，更换浓度为800 μg/ml的g418培养液筛选，以未转染细胞作对照。对照细胞全部死亡时再更换一次筛选液，降低g418浓度至200 μg/ml维持筛选；抗性细胞克隆长大后移至24孔板培养，得到稳定转染细胞株，命名为rnai组细胞；空载体转染细胞作质粒对照。以smmc7721细胞为空白对照，流式细胞仪(facscan, becton dickinson)检测荧光载体转染效率。

　　1.5 细胞总rna提取及rtpcr 检测基因沉默效果

　　trizol法提取细胞总rna,按takara反转录试剂盒说明书合成cdna第一链。以cdna第一链为模板，pcr反应扩增hmga1和gapdh，引物参见文献[3]；hmga1 30个循环，gapdh 25 个循环。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪（image master, pharmacia biotech,usa）紫外线下检测并拍照，比较各组灰度变化。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞周期

　　将各组细胞以2×104 /well密度接种6孔板上72小时，待生长接近融合时用0.25% 胰蛋白酶消化， hanks液洗涤，800 r/min离心5分钟，弃上清，余液悬浮细胞，加入预冷70% 酒精固定过夜。上机前pbs洗一次，加pi染液核染色30分钟，上机检测。每组细胞重复3个样本。

　　1.7 mtt法检测细胞增殖

　　将各组细胞以2 000个/well的密度接种于96孔板，体积200 μl/well。从接种后当天开始进行mtt检测, 酶标仪(biorad,model550)570 μm 处测od值。连续测8天,每个时间点设5复孔。根据吸光度值绘制曲线，比较各组细胞生长速度的变化。

　　1.8 统计学分析

　　实验数据用microsoft excel进行分析处理；样本显著性分析用组间比较t 检验。

　　2 结果

　　2.1 荧光载体转染效率

　　facs检测显示，质粒对照组和rnai组转染效率均在90%以上，说明质粒转染效果良好。

　　2.3 sirna抑制hmga1基因的rtpcr检测

　　rtpcr产物电泳显示，质粒对照组hmga1 mrna表达未受抑制，与空白对照组无显著差异；而rnai组hmga1 mrna表达与对照组相比则明显受到抑制，说明rna干扰载体构建有效，能够有效地抑制转染细胞中hmga1mrna的表达（见图1）。

　　2.4 sirna对转染细胞凋亡的影响

　　facs检测显示：rnai组在g1期前有明显的凋亡峰存在,凋亡细胞百分比为29.46±3.04%，显著高于质粒对照组和空白对照组(1.96±0.76%和2.04±0.70%，p<0.01；见图2 )。

　　2.5 sirna对细胞周期与增殖的影响

　　facs检测显示，rnai组g0g1期细胞百分数（75.21±2.35%）显著高于质粒对照组和空白对照组(37.98±3.02% 和39.23±3.63% ，p<0.01)，而g2s期细胞(24.79±2.35%)则显著低于其他两组(62.03±3.01% 和60.77±3.63% ，p<0.01；见图3)。mtt法检测显示，各组细胞生长在培养的前5天内无显著差异。自第6天开始， rnai组细胞增殖明显低于两对照组（p<0.01或0.05），这种变化一直持续到第8天实验结束；两对照组间未发现有显著差异（p>0.05，见图4）。

　　3 讨 论

hmga1是结构性转录因子，能调控多种基因转录，这些受调控的基因中有许多直接参与肿瘤形成和转移[1]；hmga1抑制p53基因的抑癌活性，阻止细胞对损伤dna的修复，过度活化ras/erk 信号转导通路等，这些都是肿瘤生长的重要促进因素[4-6]。最近的研究发现，hmga1可通过诱导胰岛素受体表达增加肿瘤恶性程度和转移倾向[7]。鉴于hmga1在肿瘤发生发展中的重要作用，沉默该基因可能对肿瘤细胞生物学行为产生重要影响。
本实验用靶向hmga1的rnai质粒转染mmc7721细胞，筛选基因沉默hmga1稳定转染细胞，采用facs检测转染效率和rtpcr检测hmga1 mrna表达鉴定筛选成功，以此为技术平台采用mtt法和facs检测肿瘤细胞生长和细胞周期。结果显示：hmga1基因沉默后肿瘤细胞生长速度显著低于对照组细胞；g0g1期细胞百分率显著高于对照组，g2s期细胞百分率显著低于对照组；g1期前有凋亡峰存在，且凋亡细胞百分数显著高于对照组，说明基因沉默hmga1抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

总之，本实验建立了研究基因沉默hmga1肿瘤细胞的技术平台，发现hmga1可调控肿瘤细胞生长和凋亡，其机理及基因沉默hmga1后对肿瘤细胞免疫抑制等方面的影响还有待于后续实验研究。

【参考文献】
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　　3 朱明光，张 鑫，袁红艳 et al.靶向高迁移率族蛋白a1基因rna干扰真核表达载体的构建.中国生物制品学杂志\[j\].2007；20（1）：17.

　　4 frasca f, rustighi a, malaguarnera r et al. hmga1 inhibits the function of p53 family members in thyroid cancer cells\[j\]. cancer res,2006;66(6):29801989.

　　5 adair j e, kwon y, dement g a et al. inhibition of nucleotide excision repair by high mobility group protein hmga1\[j\]. j biol chem,2005;280(37):321843292.

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