【摘要】 利用n,n二甲基甲酰胺同时萃取血样中痕量的锌原卟啉和原卟啉，以三维荧光交替三线性分解算法和导数恒基体同步荧光法同时分析血样中的锌原卟啉和原卟啉。前者中锌原卟啉和原卟啉分别在0.6～35 μg/l和0.4～27 μg/l范围内呈良好的线性，检出限分别为0.18和 0.12 μg/l;后者中锌原卟啉和原卟啉在0.14～45 μg/l和0.056～28.5 μg/l范围内呈良好的线性，检出限分别为0.12和 0.045 μg/l。实际血样中两种方法的平均回收率分别为(82±9)%和(85±10)%，且两种方法测定20份血样时获得的相关性良好。
【关键词】 卟啉，导数恒基体同步荧光法，三维荧光交替三线性分解算法, 血样
1 引 言
常规的荧光光谱法灵敏度较高，然而多组分分析时往往存在光谱干扰。近年来，为了提高荧光法的选择性，研究人员一方面发展了同步荧光光谱法，该法具有简化谱图、减少光散射、提高选择性等特点，适合于多组分混合物的分析，如lin等[1]建立了粪样中原卟啉和粪卟啉的导数恒基体同步荧光分析技术;另一方面引入化学计量学(如交替三线性分解二阶校正荧光法)的方法[2]，以“数学分离”替代“化学分离”，实现复杂体系感兴趣多成分的同时定量测定。如文献[3,4]中采用三维荧光交替三线性分解算法来定量分析氨基酸口服液中的酪氨酸和色氨酸。
卟啉是在生命机体的新陈代谢中的重要物质。当铅、砷中毒或者缺铁性贫血时，患者血液中锌原卟啉的水平明显升高[5,6];红细胞原卟啉症患者则是血液中原卟啉浓度升高[7,8]，所以测定血液中卟啉的种类和浓度可以为临床筛查和诊断提供重要依据，对铅、砷污染的环境监测也具有重要意义。目前，已建立的卟啉检测方法有荧光法[9]、分光光度法[10]、高效液相色谱法[11]和色谱质谱联用法[12]等。例如piomelli[13]和chen[14]提出的常规的荧光光谱法，需要通过数学计算引入光谱补偿因子来校正原卟啉的荧光强度，才能同时测定血样中的锌原卟啉和原卟啉;周培琛等[15]提出了导数可变角同步荧光法分析光谱严重重叠的原卟啉和锌原卟啉。
本研究建立了分析痕量锌原卟啉和原卟啉的两种方法：三维荧光交替三线性分解算法和导数恒基体同步荧光法，将其用于血样的测定，并比较了两种方法的测量结果。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
除特别指明外，所得的荧光光谱均在实验室自制的荧光仪上绘制[15]; 150 w氙灯作光源，光电倍增管负高压为-700 v。单色器的激发和发射的光谱通带均为5 nm，扫描速度为240 nm/min。以visual basic for excel编写程序，从激发与发射光谱数据计算得来的激发发射矩阵用于获取合适的恒基体同步荧光光谱扫描路径，同时采用电子微分系统获取导数光谱。
三维(3d)扫描选择em模式，激发波长为350～450 nm，间隔5 nm;发射波长为560～670 nm，间隔5 nm。扫描速度为480 nm/min。本实验获取的三维荧光数阵在matlab环境下利用交替三线性分解算法(atld)解析[2]。
原卟啉二钠盐(aldrich公司)， 锌原卟啉(strem公司)， n,n二甲基甲酰胺(dmf)，均为分析纯;血样来自厦门大学医院。实验使用1 cm × 1 cm石英比色皿，rjtgl16c型高速离心机(江苏无锡市瑞江分析仪器有限公司)。
2.2 实验方法
锌原卟啉(znpp)和原卟啉(pp)标准溶液的配制：分别准确称取1.2 mg锌原卟啉和原卟啉二钠盐，用dmf稀释至50 ml，得到浓度分别为38.4和39.6 mmol/l。避光保存于冰箱中，用时再逐级稀释至所需要浓度。
配制一系列浓度分别为1.14, 2.28, 4.56, 11.4, 18.2, 22.8和34.2 μg/l锌原卟啉的dmf溶液，为实验中测定血液中锌原卟啉的校正集。在此范围内待测物的浓度与荧光强度呈线性关系。配制浓度分别为0.57, 1.14, 2.28, 4.56, 11.4, 18.2和27.4 μg/l原卟啉的dmf溶液， 作为实验中测定血液中原卟啉的校正集。
3 结果与讨论
3.1 三维荧光交替三线性分解算法[3，4]同时测定锌原卟啉和原卟啉
采用交替三线性分解算法分解由校正样和预测样荧光数据组成的数据阵(22×21×12)，预测结果如表1。5次测定所得锌原卟啉和原卟啉的平均回收率分别是：(101±7)%和(95±10)%。根据实际血样中的卟啉浓度，建模所选的锌原卟啉和原卟啉的浓度线性范围分别为0.6～35 μg/l和0.4～27 μg/l。锌原卟啉和原卟啉工作曲线方程分别为：y=0.0688x-0.0405和y=0.0581x-0.0231，相关系数分别为0.996和0.998。以3倍空白标准偏差除以工作曲线斜率计算锌原卟啉和原卟啉的检出限分别为0.18和0.12 μg/l。表1 预测样品的浓度和回收率
pp (%)16.87.11043.42.98529.18.4926.85.885320.520.29813.713.296425.125.910316.016.4102529.632.711022.824.6108 pp: protoporphyrin ⅸ. 为了验证解析得到的光谱的真实性，将其与仪器上直接获取的光谱进行对比，从图1可见， 图1 锌原卟啉和原卟啉的激发与发射谱
实线代表atld算法分辨得到的光谱，划线代表真实的光谱(real line represents resolved spectra by alternating trilinear decomposition(atld), dash line represents true spectra).算法解析得到的光谱与仪器扫描的结果几乎完全吻合。
3.2 导数恒基体同步荧光法[1]同时测定锌原卟啉和原卟啉
3.2.1 扫描路径的选择 为了建立适用于同时测定血样中的锌原卟啉和原卟啉的恒基体同步荧光法，选择一条最佳的扫描路径非常重要，目的是为了得到最佳的恒基体同步扫描光谱(最高的信号值，无干扰的谱带)。考察了原卟啉的三维光谱(图2)，获取它在该点的荧光强度，进而得到一系列等荧光强度的点，将这些点连接起来就构成原卟啉的恒基体扫描路径(ab段)，由于原卟啉不干扰锌原卟啉的测定，所以锌原卟啉扫描路径选择相对简单，只需经过锌原卟啉的最高点即可(bc段)。结合导数技术之后，ab段扫描可以消除锌原卟啉的信号，得到原卟啉的净信号。同样地，bc段的扫描得到的是锌原卟啉的信号。因此，只需一次扫描就可以同时测定锌原卟啉和原卟啉。
3.2.2 恒基体同步荧光光谱 利用上述扫描路径，扫描一次只需30 s，就可以绘制锌原卟啉和原卟啉的导数恒基体同步荧光光谱。图3显示了锌原卟啉、原卟啉标准溶液以及它们的混合溶液的导数恒基体同步荧光光谱。混合溶液中锌原卟啉和原卟啉的光谱峰与单组分溶液的完全一致，且两个组分相互之间没有干扰。
图2 9.1 μg/l原卟啉(a)和8.5 μg/l锌原卟啉(b)的荧光等高线图以及扫描路径(c)
fig.2 contour maps of 9.1μg/l pp(a)and 8.5 μg/l znpp(b). the scanning path abc(c) is for matrix isopotential synchronous spectrum(misf) 图3 11.4 μg/l原卟啉(划线)、11.4 μg/l锌原卟啉(点划线)混合物(实线)及其溶剂(点线)的二维导数恒基体同步荧光光谱
fig.3 2dderivative matrix isopotential synchronous spectra of 11.4 μg/l pp(dash line) and 11.4 μg/l znpp(dash dot line), the mixture with the same concentration as before(real line) and solvent(dot line) 分 析 化 学第37卷第7期黄 维等：两种荧光方法分析血样中锌原卟啉和原卟啉 3.2.3 人工合成样分析 配制不同浓度的原卟啉和锌原卟啉系列混合溶液，扫描导数恒基体同步荧光光谱，并在同一条件进行标准曲线的测量，4次测量获得的锌原卟啉和原卟啉平均回收率分别为(91±4)%和(102±9)%，具体数据见表2。表2 人工合成样的回收率
采用最小二乘法拟合得到锌原卟啉和原卟啉的线性方程分别为y=42.8x+3.16和y=52.2x+13.8,相关系数均为0.999。锌原卟啉和原卟啉的线性范围分别为0.14～45 μg/l和0.056～28.5 μg/l。以3倍空白标准偏差除以工作曲线斜率计算锌原卟啉和原卟啉的检出限分别为0.12和0.045 μg/l。
3.3 血样提取液中锌原卟啉和原卟啉的测定以及两种方法的对比
为了验证两种方法的准确性，进行了实际样品的加标回收实验。对8份不同血液平行处理后进行测定。4份用三维荧光交替三线性分解算法计算，4份采用导数恒基体同步荧光法，测得的回收率见表3。三维荧光交替三线性分解算法的平均回收率为(82±9)%，导数恒基体同步荧光法的平均回收率为(85±10)%。对同一血样平行测定4次获得三维荧光atld法中锌原卟啉和原卟啉的相对标准偏差分别为1.9%和 6.7%;而导数恒基体同步荧光法中锌原卟啉和原卟啉的相对标准偏差分别为1.5%和4.4%。
为了验证两种方法的可行性，进行了实际样品的测定。表4中列出了两种方法测得的20份随机抽取的人血样中卟啉的浓度，两种方法测量结果相关性良好，锌原卟啉和原卟啉的相关系数分别为0.957和0.944。采用三维荧光交替三线性分解算法时，用核一致法对由校正样和实际样组成的三维数阵(22×21×27)进行分析。当预估计因子数为3时，函数值接近于1;当预估计因子数>3时，其函数值从1急剧下降。因此，可确定数阵的因子数为3。表3 血样萃取液中原卟啉和锌原卟啉的不同加标浓度的回收率注(note)：未带*的是用三维荧光atld方法测定，带*的是用导数恒基体同步荧光法(dmisf)测定(*: the results of derivative matrix isopotential synchronous fluorescence spectrometry; the others were the results of alternating trilinear decomposition method).表4 两种不同荧光方法分析血样中锌原卟啉和原卟啉
综上所述，三维荧光交替三线性分解算法和导数恒基体同步荧光法均能同时测定血样中痕量的锌原卟啉和原卟啉，结果令人满意。因此，两种方法均可以作为血液中卟啉分析的手段。导数恒基体同步荧光法一次光谱扫描所需要的时间仅30 s，简单快速，但更适应于两组分体系分析;若对三组分以上体系分析，三维荧光交替三线性分解算法应更易实现。
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