刺猬蛋白促进内耳表达的实验研究方法(刺猬蛋白促进内耳表达的实验研究过程)

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【摘要】 　　目的 研究刺猬蛋白(shh)对体外小鼠耳蜗多潜能祖代细胞(cnps)的math1的调节作用，探讨治疗感音神经性耳聋的新方法。 方法 体外分离培养出生后第1天小鼠的cnps细胞，在dmem/f12+shh培养基培养，用rtpcr、荧光素酶检测系统、免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪等方法检测诱导cnps细胞早期分化的重要转录因子math1的表达。 结果 shh诱导分化组的math1 mrna表达、math1启动子的转录水平及math1蛋白表达阳性率均高于未诱导细胞(p<0.05);抑制剂ly294002具有显著下调shh对math1启动子转录水平和math1蛋白表达的作用(p<0.05)。 结论 出生后第1天小鼠的cnps细胞能够在shh的诱导下，促进math1的转录和表达，诱导耳蜗毛细胞的早期分化。

【关键词】 耳蜗 基因表达 毛细胞 反式激活因子类 听觉丧失 感音神经性 逆转录聚合酶链反应

　　大多数的感音神经性耳聋是由毛细胞和与之相联系的螺旋神经的损伤和退化所造成。耳蜗祖毛细胞存在于哺乳动物的耳蜗，并且有取代缺失的听毛细胞的潜能，但这些细胞处于静止状态，并不会自发增生或分化为毛细胞[15]。目前尚未发现哺乳类动物内耳毛细胞自发再生的现象。虽然迄今国内外已进行了许多研究，但尚未发现促使内耳毛细胞再生的有效方法。本研究通过体外诱导小鼠耳蜗多潜能祖代细胞(cochlear neural progenitors,cnps)的math1的表达，探讨刺猬蛋白(sonic hedgehog，shh)对耳蜗毛细胞早期分化的作用，为感音神经性耳聋治疗提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 cnps细胞的分离培养、诱导 出生后第1天的小鼠(c57bj/6，美国明尼苏达州大学)，颈椎脱臼法处死，在显微镜下精确分离出耳蜗组织，从耳蜗组织内分离出耳蜗细胞，使用dmem/f12+1%n2+egf(10 ng/ml)+bfgf(10 ng/ml)培养基，置于37 ℃、体积分数为0.05的co2饱和湿度培养箱中培养，发现细胞传代良好，并行细胞克隆分析，挑选单细胞克隆。取第45～55代形态较好的细胞，用dmem/f12培养基洗涤，实验组加入dmem/f12+shh培养液，对照组加入dmem/f12+pbs培养液，正常细胞形态也作为一种对照，置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为0.05的co2培养箱培养1 d，每天换液，倒置显微镜(日本zeiss公司)下观察细胞形态及生长情况。

　　1.2 cnps细胞math1、myosinviia、p27kip1、s100a、ν3tubulin、map2的mrna表达水平测定 提取实验组、对照组及正常cnps细胞的mrna，进行mrna浓度、纯度、完整性检验，按一定的方法转换为cdna，后进行pcr扩增。引物由美国integrated dna technologies公司合成。

　　内参gapdh(441 bp)：

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　　math1(452 bp)：

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　　myosinviia(628 bp)：

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　　p27kip1(524 bp)：

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　　s100a(500 bp)：

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　　β3tubulin(542 bp)：

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　　map2(535 bp)：

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　　扩增条件：94 ℃ 10 min→94 ℃ 30 s→退火温度 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃ 5 min。math1、myosin viia、p27kip1、s100a、β3tubulin、map2及gapdh的退火温度分别为58.5、65、66、63、59、62.5及61 ℃。gapdh系管家基因，是小鼠细胞内普遍稳定表达、表达量较恒定的基因，因此作为内源性基因模板标准。

　　取pcr产物，加入sybr green和蓝色染料混匀后经2%琼脂糖凝胶中电泳分离，同时2%琼脂糖凝胶中加入dna ladder电泳，dna ladder起标示电泳条带位置作用，将电泳后的琼脂糖凝胶在电泳显像仪分析、摄像。

　　1.3 荧光素酶检测系统检测shh对math1启动子的表达作用 将cnps细胞放于12孔细胞培养板，24 h当细胞密度达到60%，使用lipofectin(终浓度6 μg/ml)同时转染math1启动子(终浓度1.4 μg/ml)和βgalactosidase(终浓度0.7 μg/ml)，16 h后，含4%胎牛血清的培养液恢复24 h，dmem/f12洗涤后，实验组加入dmem/f12+shh(1 μg/ml)培养液24 h，阳性对照组加入dmem/f12+pbs培养液24 h，阴性对照组加入mem培养液24 h，另外的组在添加shh基础上同时添加各种抑制剂pd98059、sb203580、ly294002(三者均为20 μmol/l，德国calbiochem公司)、cyclopamine(cy)5 μmol/l(美国biomol公司)24 h，抑制剂在添加shh前1 h添加于原先培养液中。按说明书于微孔板荧光发光计(美国tristar lb941 berthold，tropix公司)读数，βgalactosidase为细胞内参照，第一次读数luciferase与第二次读数βgalactosidase的比值rla(relative luciferase activity,luc/βgal)即是处理因素对math1启动子的调节效率。

　　1.4 免疫荧光细胞化学技术检测shh对math1蛋白的表达作用 将cnps细胞放入8孔细胞培养板，24 h当细胞密度达到40%，dmem/f12洗涤后，实验组加入dmem/f12+shh(1 μg/ml)培养液，对照组加入dmem/f12+pbs培养液，另一组加入dmem/f12+shh(1 μg/ml)+抑制剂ly294002(20 μmol/l)混合液体，每天换液。2 d后先用pbs洗涤细胞2遍，用100%甲醛固定6 min后开始染色过程。先用pbs冲洗2遍，含0.3%tritonx的pbs室温孵育10 min，含0.3%tritonx的pbs洗涤5 min×3次，加入含5%兔血清和0.3%tritonx的pbs，37 ℃孵育20 min，以阻断非特异性的抗原抗体反应。加入的一抗为兔抗鼠math1抗体1∶100(美国abcam公司)，37 ℃孵育60 min，含0.3%tritonx的pbs洗涤5 min×3次，加入含fitc goat antirabbit igg conjugated的二抗1∶200(美国zymed公司)，37 ℃孵育30 min，含0.3%tritonx的pbs洗涤5 min×3次，dapi避光染核10 min，pbs洗涤5 min×3次后封片。同时以igg作为一抗的阴性对照。在荧光显微镜(e400，日本nikon公司)下观察结果。

　　1.5 流式细胞仪检测shh对math1蛋白的表达作用 将cnps细胞放入6孔细胞培养板，24 h后当细胞密度达到60%，dmem/f12洗涤后，实验组加入dmem/f12+shh(1 μg/ml)培养液，对照组加入dmem/f12+pbs培养液，每天换液。2 d后按收获细胞的方法获取细胞，先用pbs洗涤细胞2遍后离心，弃上清，含0.3%saponin的pbs冰上孵育10 min后离心，弃上清，加入含1%bsa和0.3%saponin的pbs，冰上孵育30 min，以阻断非特异性的抗原抗体反应。加入的一抗为兔抗鼠math1抗体1∶100(美国abcam公司)，冰上孵育30 min，含0.3%saponin的pbs洗涤后离心，弃上清，加入含fitc goat antirabbit igg conjugated的二抗1∶100(美国zymed公司)，冰上孵育30 min，pbs洗涤后离心，弃上清，重复pbs洗涤1次，将细胞溶解于含0.1%bsa的pbs。同时以igg作为一抗的阴性对照，流式细胞仪(美国bd biosciences公司)检测结果，后使用flowjo软件分析。

　　1.6 统计学处理 数据以x±s表示，使用sigmaplot软件作图分析。两组间采用t检验，p<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态改变和鉴定 刚分离时细胞小而圆，折光性强，传代后细胞小而纺缍样，贴壁生长，传代50代后细胞仍存活。用rtpcr检测毛细胞的标志物:math1、myosinviia;支持细胞标志物p27kip1、s100a;神经元标志物：β3tubulin、map2，结果显示此细胞表达math1、myosinviia、p27kip1、s100a、β3tubulin，但不表达map2。取第45～55代的此细胞，shh处理1 d后细胞体积增大、变圆，呈神经元样或上皮样改变 (图1)。

　　2.2 rtpcr检测mrna的表达水平 实验组shh(1 μg/ml)处理cnps细胞1 d后math1 mrna表达水平明显高于对照组pbs，也明显高于未经过处理的cnps。实验组shh与对照组pbs处理cnps细胞后，cnps细胞在p27kip1、s100a、β3tubulin mrna的表达上未见明显差异。实验组shh与对照组pbs处理cnps细胞3 d后的myosinviia mrna表达水平高于未经过处理的cnps(图2)。 a：正常细胞形态，细胞小而纺缍样，贴壁生长;b：实验组，shh 1 μg/ml，24 h后细胞体积变大、变圆，呈神经元或上皮样改变.

　　2.3 荧光素酶检测系统检测shh对math1启动子的表达作用 实验组shh(1 μg/ml)处理cnps细胞1 d后对math1启动子的转录水平明显高于阴性对照组mem，实验组shh与阴性对照组相比，差别有显著性意义(p<0.05)，略高于阳性对照组pbs。抑制剂ly294002具有显著下调shh对math1启动子的转录水平作用，与shh组相比，差别有显著性意义(p<0.05，图3)。

　　2.4 免疫荧光细胞化学技术检测shh对math1蛋白的表达作用 荧光显微镜下，在fitc频道，细胞核显示绿色荧光的细胞为阳性细胞，在dapi频道下，蓝色荧光所示的是细胞核，起标示细胞作用。在1个高倍视野下，选择4个角落和1中心，共5个高倍视野来计算阳性细胞，取4个不重复视野，计算阳性细胞数量和百分数。实验组shh(50.72±17.34)%处理cnps细胞2 d后math1蛋白的表达水平明显高于对照组pbs (33.3±9.37)%，与对照组pbs相比，认为差别有统计学意义(p<0.05)。ly294002(23.5±8.56)%具有明显下调shh对math1蛋白的表达作用，具有显著差别(p <0.05)(图4a～b)。

　　实验组：shh 1 μg/ml;阴性对照组：mem;阳性对照组：pbs;pd98059组：shh 1 μg/ml+pd98059 20 μmol/l;sb203580组：shh 1 μg/ml+sb203580 20 μmol/l;ly294002组：shh 1 μg/ml+ly294002 20 μmol/l;cy组：shh 1 μg/ml+cyclopamine 5 μmol/l;处理时间：24 h. 实验组与阴性对照组比较，p<0.05;实验组与ly294002组比较，p<0.05.

　　3 讨 论

　　感音神经性耳聋是毛细胞和与之相联系的螺旋神经的损伤或退化所造成。目前尚无治疗感音神经性耳聋的有效方法，助听器和人工耳蜗虽有助于提高听力，但不是从生物学意义上逆转听力。因此，寻求促使内耳毛细胞再生的有效途径仍是感音神经性耳聋防治研究的重点。以往研究表明，哺乳类动物的耳蜗毛细胞在胚胎期已完成分化，出生后不能自发再生。其内耳毛细胞的数目从出生至衰老，基本维持在稳定水平[6]。因此，毛细胞的任何损伤和破坏都可导致永久性听力损害。但是，近年研究表明，哺乳类动物出生早期阶段存在cnps细胞[7]。从cnps细胞直接诱导分化来补充毛细胞和螺旋神经元，有可能恢复内耳的生物学结构，为感音神经性耳聋的治疗提供新途径。

　　近年，lin等从出生后第1天小鼠耳蜗组织中分离出耳蜗细胞，经鉴定，认为这些细胞是cnps细 a:荧光显微镜下观察cnps细胞的math1蛋白的表达作用; b:荧光显微镜下观察cnps细胞中math1阳性细胞的百分数. a：对照组：pbs;b：实验组：shh 1 μg/ml;c：ly294002组：shh 1 μg/ml+ly294002 20 μmol/l;处理时间：48 h. 实验组与对照组比较，p<0.05;实验组与ly294002组比较，p<0.05.

　　胞，并发现第45代cnps细胞与第5代cnps细胞具有相似的形态学改变和生物学性质，即细胞具有自我更新能力。约有90%左右的单细胞具有不对称分裂为2个不同子细胞(毛细胞和神经元方向)的能力，即细胞具有多向分化的能力，但其自身不具备分化为成熟毛细胞的能力。lin等用组合生长因子serb(刺猬蛋白(shh)、表皮生长因子(egf)、视黄酸(ra)和脑源性神经营养因子(bdnf)对cnps细胞进行诱导培养，发现cnps具有分化为神经元、毛细胞的能力，且cnps细胞在成熟毛细胞纤毛束的标志物espin、factin的表达水平明显增强[7]。但上述组合因子对cnps细胞的诱导培养时间长、过程较繁琐，且各因子对耳蜗毛细胞分化的具体作用机制尚不明了。

　　本实验所使用的耳蜗细胞培养至50代后对其 实验组：shh 1 μg/ml;对照组：pbs;处理时间：48 h.进行标志物检测。rtpcr显示math1、myosinviia、p27kip1、s100a、β3tubulin均呈阳性表达，但不表达map2。因β3tubulin是不成熟神经元的标志物，在成熟神经元的表达量较少，map2是较成熟神经元的标志物[7]，说明此细胞处于分化早期。以上结果表明本实验培养的细胞与lin所认为的cnps细胞特征一致。

　　本实验主要研究单因子对耳蜗毛细胞的分化作用，其中shh在内耳的发生发育过程中起重要作用。研究表明，在神经系统，nkx21决定神经祖细胞向某些神经元亚型转化的方向，并调控有丝分裂后期某些神经元的迁移或分化[8]。shh在前脑存在表达，与前脑的发育有关，且shh与维持腹侧前脑结构的某些基因(例如nkx21)的表达有直接关联[9]。shh基因敲除的小鼠没有听泡的腹侧囊泡，包括缺失蜗水管和耳蜗前庭神经节[1011]，说明shh在内耳的发育形成中起关键作用。

　　1998年，atoh1(math1)基因首先在果蝇基因中被发现，小鼠同系物math1位于小鼠6号染色体,编码351个氨基酸。math1是一种产生毛细胞所必需的碱性螺旋环螺旋的基因转录调控因子[5，1213]。math1本身可促进毛细胞早期分化[5]。math1的基因转移使出生后哺乳动物的耳蜗产生功能性的毛细胞[14]。本实验利用出生后第1天小鼠耳蜗组织的cnps细胞来研究shh通过调节cnps细胞早期分化的转录调控因子math1，诱导cnps细胞分化的机制。对于本实验研究的cnps细胞，在无其他相关因子和血清存在的情况下，通过rtpcr、荧光素酶检测系统、免疫荧光细胞化学技术、流式细胞仪检测结果发现，shh诱导math1表达的适宜浓度为1 μg/ml。

　　本实验中，实验组shh处理cnps细胞48 h，cnps细胞的math1蛋白表达(ihc和facs)增加10%～15%，具有显著性意义，此后回到原始水平，推测与下列因素有关：(1)math1通常出现在有丝分裂后期，终分化前期，时间短暂。(2)被上调的math1是短暂出现的，math1的表达在细胞遭受刺激后24～48 h存在一个高峰，此后其表达将恢复到原始水平。math1的短时增加现象，使胚胎后期和出生早期math1的表达不易检测出。本实验中，采用了dmem/f12培养基，不使用血清，不使用促神经细胞生长的因子n2，不使用促细胞增生的因子egf+bfgf，故更能客观地反映shh对cnps细胞的直接作用。ly294002系pi3k/akt通路的抑制物，ly294002具有明显下调shh对math1启动子转录水平和math1蛋白表达的作用，故shh促进math1的表达，与pi3k/akt信号通路有关。本实验表明shh主要通过上调math1对耳蜗多潜能祖代细胞起促分化的作用，但分化后能否转变为有功能的毛细胞，还有待于进一步探讨。

　　(致谢:本文实验的部分内容在美国明尼苏达州大学听觉分子生物实验室完成，特此表示深深的感谢!)

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