目的 探讨肝脏组织中程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）表达在慢性HBV携带者病情进展中的作用。 方法 选择慢性HBV携带者病例50例为研究对象，均予以血生化、病毒DNA、肝纤维化指标检测；患者肝穿刺活检后肝脏组织进行病理HE染色，观察肝脏组织炎症和纤维化的表现，并根据炎症结果将50例分为：A组：炎症0级；B组： 炎症≥1级。免疫组化检测肝组织PD-1表达。 结果 根据炎症结果病例分为两组：A组26例（炎症G0）和B组24例（炎症≥G1）。病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。两组患者4种血清肝纤维化指标水平均无统计学差异。与A组比较，B组肝脏PD-1表达水平明显高（P<0.05）。PD-1表达与肝纤维化分级相关性分析结果呈正相关。 结论 慢性HBV携带者肝脏组织PD-1表达水平越高，炎症及纤维化进展的可能性越大，肝脏PD-1表达可作为慢性HBV携带者病程进展的评估指标之一。
慢性HBV携带者；肝脏；纤维化；程序性死亡分子1
R512.62 B 1673-9701（2014）34-0008-03
临床上，慢性HBV携带者为处于慢性乙肝病毒感染的免疫耐受期，虽定期检查肝功能，结果往往在正常范围，CT、B超等影像学检查亦无明显异常发现，疾病的进展具有“隐蔽性”。随着病程的延长，虽然其生化指标持续在正常范围，但肝脏组织学的损伤已逐渐出现，甚至有研究报道HBV DNA高载量水平的慢性HBV携带者具有一定的肝硬化、肝癌风险。因此对于HBV携带者的肝脏损伤、纤维化评估以及早期针对性药物干预具有非常重要的临床意义。但是，目前对于此类患者肝脏损伤整体评估以及预测肝炎活动发生缺乏有效手段。PD-1是一种抑制性共刺激分子，在维持外周耐受中起关键性的作用，既往研究中描述了其在慢性病毒感染、肿瘤免疫及自身免疫性疾病的发生过程中发挥重要的生物学作用。更有研究发现其在乙肝病毒清除过程中发挥负性调控的作用，与HBV慢性感染密切相关。本研究旨在对慢性HBV携带者进行肝活检，检测肝脏组织中PD-1表达，并进一步探索其在慢性HBV携带者病程进展中的作用。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2010年11月1日～2013年2月5日在温州医科大学附属第二医院感染内科行肝穿刺活检术的慢性HBV携带者，纳入研究50例，男32例，女18例，年龄20～45岁，均无临床症状，肝脏影像学无明显异常，无其他慢性疾病史。慢性HBV携带者诊断标准参照2010年12月修订的《慢性乙型肝炎防治指南》。
1.2试剂
PD-1小鼠抗人单克隆抗体、二抗试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 实验室检查
所有病例均行HBV血清标志物、HBV DNA定量、肝纤维化血清指标检测。血清肝功能检查采用LX20PRO（Beckman coulter公司）全自动生物化学检测仪；血清乙肝免疫采用北京万泰生物技术公司ELISA试剂盒，HBV DNA检测采用深圳匹基生物工程股份有限公司试剂盒。
1.4 肝穿刺
所有病例均无肝穿刺禁忌证。B超定位下快速经皮肝穿刺活检术，每例患者穿刺2条肝脏条索组织，肝穿刺标本长度不短于1.5 cm，内径不小于1 mm。
1.5 病理学检查
肝穿刺获得的肝脏条索组织用10%中性甲醛固定，之后依次石蜡包埋、切片，行HE染色；由温州医科大学附属二院病理科2名专家阅片，病理诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南》，评定标本的炎症分级（G）和纤维化分级（S）。根据病理炎症结果将50例病例分为两组：A组：炎症G0；B组：炎症≥G1。
1.6 免疫组化检测肝脏组织PD-1表达
石蜡切片脱蜡、水化，3%双氧水孵育，双蒸水冲洗，PBS浸泡，枸橼酸缓冲液中微波修复，PBS冲洗，血清封闭，室温孵育后倾去血清，滴加PD-1一抗工作液，37℃孵育，PBS冲洗后滴加二抗工作液，37℃孵育，PBS冲洗，滴加辣根酶标记SP工作液，37℃孵育，PBS冲洗，之后DAB显色剂显色，苏木素复染。梯度酒精脱水、透明、封片。用图像分析软件Image-Pro Plus6.0重复3次读取每张片的阳性区域的吸光度值，取平均值作为蛋白的相对含量。
1.7 统计学分析
采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析，计量资料组间比较t检验；相关性分析使用非参数检验Spearman（斯伯曼/斯皮尔曼）法分析；P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1血清标志物和病毒学指标
50例患者肝功能在正常范围，ALT（31.20±11.81）U/L，均为HBeAg（+），HBV DNA：10^5～10^8拷贝/mL。病理学结果见表1。并根据炎症结果分为两组：A组26例（炎症G0）和B组24例（炎症≥G1）。A组病例中S2分级的6例，B组病理中S2分级的6例，S3分级的有3例，病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。
2.2 血清肝纤维化指标检测结果
A组和B组患者4种血清肝纤维化指标水平均无统计学差异（见表2）。
2.3 免疫组化检测肝脏组织PD-1表达结果
A组患者肝脏组织PD-1平均光密度值为（1.56±0.39），B组为（2.87±0.62）。B组患者肝脏组织PD-1表达水平明显高于A组（t=9.05，P<0.05）。50例患者纤维化S0级（11例）PD-1平均光密度值为（1.86±0.52），纤维化S1级（24例）PD-1平均光密度值为（2.07±0.69），纤维化S2级（12例）PD-1平均光密度值为（2.58±0.65），纤维化S3级（3例）PD-1平均光密度值为（2.82±0.15）。
2.4 PD-1与肝纤维化相关性分析
PD-1表达与肝纤维化分级呈正相关，相关系数rs=0.356，P=0.011<0.05。PD-1表达与肝脏炎症分级呈正相关，相关系数为rs=0.780，P=0.000<0.05。
3 讨论
乙肝病毒感染是我国最常见的肝脏感染性疾病，据统计慢性HBV感染者约9300万人，而其中慢性HBV携带者占了很大的比重。慢性HBV携带者，经各项检查如肝功能以及CT、B超等影像学检查往往无明显异常的发现。但是，近年来愈来愈多的研究提示，乙肝进展具有“隐蔽性”，许多ALT正常的慢性HBV感染患者，同样存在肝损害，部分患者病变程度在G2、S2以上，甚至进展到早期肝硬化阶段。本研究中也同样存在这样的情况，50例患者虽肝功能均正常范围，影像 学亦无明显异常，但病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。
PD-1是一种抑制性共刺激分子，在维持外周耐受中起着关键性的作用。既往的研究表明，PD-1与病毒感染后病毒特异性T淋巴细胞功能衰竭及免疫耐受有关，其抑制病毒的清除，有助于病毒感染的慢性化；Tao等使用流式细胞仪检测37例慢性丙肝病毒感染患者与17例正常健康者的血标本，结果发现丙肝病毒慢性感染者CD8+淋巴细胞上PD-1表达强度及百分比均较高于正常组。
研究也发现PD-1在乙肝病毒清除过程中发挥负性调控作用，与HBV慢性感染密切联系。免疫耐受是HBV感染慢性化的主要机制，PD-1通过切断自身反应性T细胞诱导免疫耐受，并抑制效应性T细胞维持免疫耐受。因此，HBV的持续感染与PD-1的表达上调有关。随着对PD-1研究的深入，更有研究发现，肝脏组织中PD-1表达与炎症程度具有相关性。韦麒等研究发现随着炎症活动度的加重，PD-1的表达也更为显著。但是目前对于慢性HBV携带者患者肝组织PD-1表达的临床研究鲜有报道。
本研究纳入50例慢性HBV携带者，肝穿刺活检后病理染色，并进一步免疫组化检测肝脏组织PD-1表达肝脏组织，并根据炎症结果分为两组：A组26例（炎症G0）和B组24例（炎症≥G1）。结果发现：B组患者肝脏组织PD-1表达水平明显高于A组（P<0.05），也证明了在慢性HBV携带者，肝脏组织炎症程度影响PD-1的表达。有学者认为，PD-1的表达增强使得免疫功能受到抑制，以避免持续活化的免疫应答导致肝脏过度受损而引发功能进一步恶化，但同时也使T细胞功能低下而不利于机体清除病毒，导致感染的慢性持续。因此，PD-1表达上调是机体在肝脏炎症反应加剧时的一个自我保护调节，也可以推断在机体对乙肝病毒免疫应答与免疫介导的肝脏损害中，PD-1表达可能起到平衡的作用。本研究对慢性HBV携带者患者肝组织PD-1表达与肝脏炎症分级进行了相关性分析，结果显示PD-1表达与肝脏炎症分级呈正相关（rs=0.780，P<0.05）。
近年研究表明，PD-1过度表达与多种脏器纤维化有关，机制可能为PD-1作用后介导的抑制信号可调节T 淋巴细胞的过度激活，有效抑制T淋巴细胞增殖及细胞因子的分泌， 参与了众多组织增生、肥大及纤维化。本研究对肝脏PD-1表达与肝纤维化分级进行了相关性分析，结果显示PD-1表达与肝纤维化分级呈正相关（rs=0.356，P<0.05）。
综上所述，PD-1表达水平越高，慢性HBV携带者炎症及纤维化进展的可能性越大。因此，检测PD-1的表达有助于评估肝脏组织炎症及肝纤维化程度，肝脏PD-1表达可作为慢性HBV携带者病程进展的评估指标之一。
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