【关键词】 猝死,心脏;连接蛋白43;连接蛋白40;免疫组织化学
【摘要】 目的 观察心脏性猝死病人左、右心室肌及室间隔肌缝隙连接蛋白43(cx43)及缝隙连接蛋白40(cx40)的表达，探讨cx43、cx40表达与心脏性猝死的关系。方法 应用免疫组化及simple pci 图像分析系统，分析比较心脏性猝死与非心脏性猝死病人心室肌及室间隔肌cx43、cx40的表达，并用spss 13.0统计软件对数据进行统计分析。结果 非心脏性猝死病人cx43、cx40主要表达于心肌细胞闰盘处，少数表达于细胞侧面连接及胞浆中。心脏性猝死病人cx43、cx40多数弥散于胞浆及细胞侧面连接处，表达于闰盘的数量减少。心脏性猝死病人cx43在左心室、室间隔及右心室的表达明显低于对照组(t=2.09～8.01，p均<0.05);心脏性猝死病人cx40在左心室、室间隔及右心室的表达也明显低于对照组(t=3.24～9.40，p均<0.05)。结论 cx43、cx40表达部位的改变与表达数量的减少，可能与心脏性猝死有一定关系。
【关键词】 猝死,心脏;连接蛋白43;连接蛋白40;免疫组织化学
expressions of gap junction connexin 43 and connexin 40 in patients of sudden cardiac death lu jing, zhang qiyi, ji ping, et al (the affiliated municipal hospital of qingdao university medical college, qingdao 266011, china); [abstract] objective to study connexin 43 (cx43) and connexin 40 (cx40) expression in the left, right ventricle and interventricular septem in patients with sudden cardic death (scd) and the relationship between their expression and scd. methods immunohistochemistry and simple pci image analysis system were used to compare the expressions of cx43 and cx40 in patients with scd and patients with nonscd (control group). spss 13.0 statistical package was used for the analysis. resultsin the control group, cx43 and cx40 were mainly distributed in intercalated disk, and a few found in the lateral junction and cytoplasm. and those in scd group, the expressions were mostly dispersed in the lateral junction and cytoplasm, and a few of them observed in intercalated disk. compared with the controls, patients in scd group had a statistically lower cx43 expression in the left, right ventricle and interventricular septem (t=2.09-8.01,p<0.05), and they had also a statistically lower cx40 expression in the left, right ventricle and interventricular septem (t=3.24-9.40,p<0.05). conclusion the changes of the distribution and quantity of cx43 and cx40 in the heart may be related to the sudden cardic death to some extent.
[key words] death, sudden, cardiac; connexin 43; connexin 40; immunohistochemistry
2006年，美国心脏协会、美国心脏病协会和欧洲心脏病协会将心脏性猝死(scd)统一定义为：scd是由于心脏原因，在急性症状出现后1 h内，意识突然丧失的自然死亡。目前研究表明,scd的病种构成主要有冠心病、肥厚性心肌病等[1]。澳大利亚有关年轻人scd尸检显示，原发心律失常占31%，冠状动脉疾病占24%，肥厚性心肌病和特发性左心室肥厚占15%，心肌炎占12%[12]。scd大多发生在有器质性心脏病病人。scd病人的尸检发现，90%的scd者有冠心病。许多研究表明，20%～50%的心脏病病人首发表现是scd，在发生scd的病人中，75%可发现有陈旧性心肌梗死[3]。即使部分病人心脏无肉眼可见的病变，其分子结构和功能可能发生了变化，导致心律失常。心脏内大部分心肌细胞不受神经和心脏传导系统的直接支配，但心脏的收缩和舒张高度同步化，原因在于心肌细胞之间有大量的缝隙连接，尤其在闰盘部分。缝隙连接蛋白(cx)的表达具有种属和组织特异性，缝隙连接蛋白由高度同源基因编码，在人类心脏组织不同部位表达有所不同[4]。本研究通过免疫组化法测定scd与非scd病人左、右心室肌及室间隔肌缝隙连接蛋白cx43、cx40的表达，从而探讨cx43、cx40表达变化与scd的关系。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选取2006—2009年我院病理科诊断为scd 病人的存档标本蜡块25例(实验组)，每例均包含左、右心室及室间隔肌组织;25例病人中，男18例，年龄33～65岁，女7例，年龄28～50岁;其中冠心病性猝死22例，心肌病性猝死3例。另外，选取15例因交通意外死亡无心脏疾病者的左、右心室肌及室间隔肌组织的存档标本蜡块作为对照组，15例中男9例，女6例，年龄30～55岁。
1.2 主要实验试剂
兔抗人多克隆抗体cx43(北京中杉金桥生物技术有限公司)，兔抗人多克隆抗体cx40(abcam plc 332 cambridge science park，uk)，即用型快捷免疫组化maxvision试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司)。
1.3 实验方法
将所有切片按常规方法脱蜡至水后进行微波修复(80 ℃修复170 s后，保温10 min)，自然冷却后以体积分数0.033的h2o2常温下封闭20 min，pbs冲洗3次，每次5 min后，一份加入cx40浓缩液，按1∶50浓度稀释;另一份加cx43工作液，4 ℃冰箱过夜孵育，pbs冲洗3次，每次5 min后，再按照即用型快捷免疫组化maxvision试剂盒指定方法加二抗常温孵育15 min，pbs冲洗3次，每次5 min后，按浓缩型dab试剂盒指定的方法进行显色。用pbs代替一抗作为阴性对照，用苏木精复染核。
1.4 结果判断
心肌闰盘、胞浆、细胞侧面连接处出现棕黄色颗粒为cx43、cx40阳性表达。
1.5 图像分析与统计学处理
选取cx43、cx40表达均匀的切片，每张切片随机选取3个视野，采用simple pci图像分析系统对各切片阳性表达的棕黄色颗粒进行图像分析，用阳性染色的平均灰度值反映蛋白染色强度，用阳性染色平均面积值代表蛋白表达密度，测量数据由simple pci 图像分析系统自动获取。用spss 13.0及ppms 1.5[5]统计软件对数据进行统计分析，以p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 cx43免疫组织化学染色
对照组cx43阳性表达主要呈棕黄色，条状表达于心肌闰盘处，少部分棕黄色颗粒散在表达于胞浆、细胞侧面连接处。实验组cx43阳性表达大部分呈棕黄色颗粒，弥散于胞浆;有少部分的棕黄色颗粒表达于心肌闰盘及细胞侧面连接处，并且cx43阳性颗粒的数量减少，而且颜色变浅。scd 病人左心室、室间隔及右心室cx43的表达均明显低于对照组(t=2.09～8.01，p均<0.05)。见表1。
2.2 cx40的免疫组织化学染色
对照组cx40主要表达于心肌闰盘处，细胞胞浆和细胞侧面连接处较少;而在实验组大部分弥散于胞浆，少部分表达于细胞侧面连接、心肌闰盘处。实验组与对照组相比较cx40的阳性颗粒数量减少，颜色变浅。scd 病人左心室、室间隔及右心室cx40的表达也明显低于对照组(t=3.24～9.40，p均<0.05)。见表2。表1 两组心肌各部位cx43表达的图像分析结果 表2 两组心肌各部位cx40表达的图像分析结果
3 讨 论
3.1 cx与scd
cx是存在于动物体内多种细胞间的细胞连接通道，它是相邻细胞膜上的跨膜通道，由六聚体蛋白构成。在人类心脏的不同部位，缝隙连接蛋白的表达有差异，心室肌主要以cx43、cx40表达为主[4]。
引起scd最常见的心律失常为室性心律失常。室性心律失常的发生机制包括折返自律性增高及触发活动等。已有研究显示，心肌细胞间的缝隙连接决定心肌电激动阻滞与否[6]。心肌细胞膜通道的主动电活动不能使单个心肌细胞的兴奋传递到相邻的心肌细胞，从而引起整个心室肌的同步收缩，这一环节主要受控于cx介导的细胞间电耦联。
3.2 cx43与scd
研究显示，心肌急性缺血时，cx43表达数量及表达模式发生变化，心肌闰盘处cx43表达数量减少，使心肌纵向传导速度下降，从而引发心室折返传导，心室传导阻滞，进而诱发心律失常[7]。而一般情况下，激动传到心肌组织，不会形成折返运动[8]。慢性心肌缺血引起cx43大量降解，进而引发心律失常[9]。本研究显示， cx43主要呈棕黄色条状表达于非scd 病人心肌闰盘处，少部分棕黄色颗粒散在表达于胞浆、细胞侧面连接处;而在scd 病人cx43大部分呈棕黄色颗粒弥散于胞浆，少部分表达于心肌闰盘及细胞侧面连接处，并且cx43阳性着色的数量减少，颜色变浅。同时，scd 病人左心室、室间隔及右心室心肌cx43的表达明显低于对照组。说明cx43表达数量及表达模式的改变可能与室性心律失常引发的scd有关。
3.3 cx40与心脏疾病
cx40的基因突变可能与遗传性扩张型心肌病的发生有关。cx40表达异常所致心脏传导异常以房室传导阻滞及右束支传导阻滞为主[10]。本研究显示，非scd者cx40主要表达于心肌闰盘处，少部分表达于细胞胞浆和细胞侧面连接处，而scd 病人cx40大部分弥散于胞浆，少部分表达于细胞侧面连接、心肌闰盘处。实验组与对照组相比cx40的阳性颗粒数量减少，颜色变浅。而且scd 病人左心室、室间隔及右心室cx40的表达也明显低于对照组。说明cx40表达数量的减少及表达模式的改变可能与室性心律失常引发的scd有关。
综上所述，正常成人心室肌的电传导具有多向异性，缝隙连接蛋白主要表达于心肌闰盘处，决定其传导以纵向传导为主，而scd 病人cx43、cx40的表达自心肌细胞闰盘处向胞浆和胞膜处弥散，使其电传导由纵向传导为主转变为横向为主，从而导致室性心律失常，诱发scd。
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