hplc测蛋白浓度的灵敏度，hplc测定芦丁含量实验报告

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【摘要】 　　目的建立测定人尿液三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸（tpa）浓度的高效液相色谱法（hplc）。方法 以阿魏酸为内标（internal standard, is），志愿者尿样稀释后经ultimate xbc18柱（4.6mm×200mm，5μm）、流动相甲醇－1%醋酸（35∶65，v/v）分离，在检测波长为240nm、流速为 0.8ml/min、柱温为30℃条件下采用hplc分析。结果在1～400μg/ml内，tpa与is的峰面积比值与浓度线性关系良好（r=0.9954），定量下限为1μg/ml，低、中、高浓度的相对回收率分别为（106.0±4.4）%、（107.4±4.2）%和（108.5±2.4）%，批内和批间相对标准偏差（rsd）小于8%。结论方法符合生物样品分析要求，可用于三苯双脒次级代谢物tpa尿液浓度的测定。

【关键词】 三苯双脒 对苯二甲酸 高效液相色谱法 尿

　　 terephthalic acid by hplc

　　xu jie1,2, yuan guiyan1, wei chunmin1, wang benjie1, guo ruichen1

　　(1． institute of clinical pharmacology， qilu hospital of shandong university， jinan 250012， china;

　　2．department of bioengineering， zibo vocational institute， zibo 255013， shandong, china)

　　to develop a hplc method for determination of tribendimidine metabolite terephthalic acid (tpa) concentration in human urine. methods diluted urine was separated on the ultimate xbc18 column (4.6mm×200mm, 5μm), eluted with methanol and 1% glacial acetic acid (35∶65, v/v) at 0.8ml/min and 30℃, and detected at 240nm with ferulic acid as an internal standard (is). results a good linearity was obtained from 1 to 400μg/ml (r=0.9954). the lower limit of quantitation (lloq) was 1μg/ml. the relative recoveries were (106.0±4.4)%, (107.4±4.2)% and (108.5±2.4)% at 3, 25 and 200μg/ml, and the intra and interbatch relative standard deviations (rsd) were less than 8% for all quality control samples. conclusion the developed hplc method is proved to meet the requirements of biological sample analyses, and is appropriate for determination of urinary tribenmidine metabolitetpa in human urine.

　　key words: tribendimidine; terephthalic acid; high performance liquid chromatography; urine

　　三苯双脒（tribendimidine）是新型广谱驱肠虫药［13］，化学名为n,n′双［4′(1二甲氨基乙亚氨基)苯基］ 1,4苯二甲亚胺，po后于体内迅速分解为对（1二甲氨基乙亚氨基）苯胺（p(1dimethylamino ethylimino) aniline，dadt）和对苯二甲醛（1, 4phthaladehyde），对苯二甲醛经过体内酶氧化，迅速转化为对苯二甲酸（terephthalic acid，tpa）自尿中排泄；血中无对苯二甲醛检出。国内外文献多报道三苯双脒临床应用或药效学，鲜有其人体内处置过程［4］。文献报道［56］人尿液对苯二甲酸测定中，尿样需经高氯酸沉淀蛋白，乙酸乙酯提取，流动相中加入离子对试剂进行分离，操作较复杂。本研究建立了一个方便可行、定量准确的人尿液 tpa浓度的hplc测定方法，适合人体三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸排泄动力学研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药品与试剂 tpa对照品（批号wf20070717，含量≥99%）购自国药集团化学试剂有限公司；内标阿魏酸(ferulic acid, 批号07739910，供含量测定用）购自中国药品生物制品检定所；三苯双脒肠溶片（200mg/片，批号0505226），由山东新华制药股份有限公司提供；甲醇购自美国baker公司（色谱纯，含量100.0%）；冰醋酸购自美国tedia公司（色谱纯，含量≥99.7%）；氢氧化钠购自山东化工研究院（分析纯，含量≥96.0%）；水为市售娃哈哈纯净水。

　　1.1.2 仪器 美国waters allience高效液相色谱仪，配有waters 2695 separation module，waters 2996二极管阵列检测器，empower build 1154色谱工作站；sorvall biofuge primo离心机，购自美国科峻仪器公司；xw80a型旋涡混合器，购自上海精科实业有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件 色谱柱 ultimate xbc18柱（4.6mm×200mm，5μm）；流动相甲醇－1%醋酸（35∶65，v/v）；检测波长240nm；流速0.8ml/min；柱温30℃。

　　1.2.2 tpa系列对照品溶液 取tpa对照品约0.1g，精密称定，加1%氢氧化钠溶液溶解并稀释制成浓度为2mg/ml的对照品储备液，4℃冰箱保存备用。以水稀释配成1000、500、100、20和10μg/ml的tpa系列对照品溶液。

　　1.2.3 is溶液 取阿魏酸约0.25g，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成浓度为0.5mg/ml的is溶液，4℃冰箱保存备用。

　　1.2.4 尿样处理 取人尿液适量，5000r/min离心5min，0.45μm针筒过滤器过滤，取滤液60μl，加入is溶液70μl和水770μl，涡旋1min，取20μl进样。以内标法计算尿液中tpa浓度。

　　1.2.5 受试者选择及尿样采集 选择符合入选标准的16名男性健康志愿者，试验前签署知情同意书。志愿者随机分为3组，试验前禁食一夜，于次日早晨7点分别空腹口服200mg（5人）、 400mg（6人）和600mg（5人）三苯双脒肠溶片，200ml温开水送服，服药1h后定时定量（100ml/h）饮水，2h后进统一低蛋白、低脂肪早餐。早、中、晚餐统一进食。收集服药前和服药后0～2，2～4，4～6，6～8，8～10，10～12，12～24h的尿液，记录尿液体积，取10ml 离心后-20℃保存，备测。

　　1.3 统计学处理 分析方法精密度和准确度试验数据经excel 2003软件计算得到。志愿者不同时间段的尿药浓度及尿液体积经das2.0实用药代动力学程序（残余尿药量法）计算三苯双脒次级代谢物tpa经尿排泄速率常数（elimination rate constant, ke）和半衰期（halflife time, t1/2）。

　　2 结 果

　　2.1 专属性 取尿液，按“1.2.4”项下操作。tpa和is保留时间分别为9.8min和12.0min，尿中内源性物质不干扰tpa测定。对照品溶液、空白尿样、空白尿样加对照品和is及志愿者给药后尿样加is色谱图见图1。

　　2.2 标准曲线 取空白尿液，分别加入tpa系列对照品溶液适量，配制浓度为1、2、10、25、100、250、400μg/ml的tpa尿样系列。按“1.2.4”项下操作，每个浓度测定5次。以尿样中tpa浓度（x，μg/ml）为横坐标，tpa与is峰面积比值y为纵坐标，采用加权（1/c2）最小二乘法［7］进行线性回归运算，得回归方程y=2.68e-002x-1.47e-003，r=0.9954，r2=0.9909。在1～400μg/ml内，tpa与 is的峰面积比值与浓度线性关系良好，定量下限为1μg/ml。

　　2.3 精密度和准确度 分别用空白尿液配制浓度为3、25和200μg/ml的低、中、高3个浓度的质控样品，按“1.2.4”项下操作，每个浓度5样本于1d内测定，或每日测定1次，连续3d（每日为一批）。质控样品与标准曲线同时进行，以当日标准曲线计算质控样品浓度，计算批内、批间相对标准偏差（relative standard deviation，rsd），评价方法精密度。根据测定浓度计算相对回收率，评价方法准确度。精密度结果见表1。低、中、高3个浓度相对回收率分别为（106.0±4.4）%，（107.4±4.2）%和（108.5±2.4）%；rsd分别为4.1%、3.9%和2.2%。表1 低、中、高3个浓度的精密度

　　3 讨 论

　　本研究建立了阿魏酸为is的人尿液tpa浓度hplc测定法，该法简便、快速、灵敏、准确，符合生物样品分析要求，适合人体三苯双脒次级代谢物tpa排泄动力学研究。

　　本研究尿样无须沉淀蛋白，经离心、过滤和稀释后直接进样，预处理方法简单，回收率高，干扰少，重复性好。分离机制采用离子抑制色谱，流动相为甲醇－1%醋酸（35∶65，v/v），无需特殊离子对试剂，杂质峰与tpa分离效果良好。本研究用内标法定量，较文献报道［56］的外标法误差小。is 曾试用阿司匹林、苯甲酸、水杨酸和甘草次酸，分离效果或分析时间不理想。以阿魏酸为is，尿液中杂质峰与tpa和is分离良好，且保留时间适中，有利于提高测定效率。

　　三苯双脒口服后于体内迅速分解为dadt和对苯二甲醛，对苯二甲醛经体内酶迅速氧化成tpa自尿中排泄，血中无对苯二甲醛检出。作为国家一类新药，三苯双脒体内处置过程尚未完全清楚，其参与酶类、肠道菌群或反应类型有待进一步研究。文献报道［8］tpa经肾排泄存在分泌和重吸收机制，可能导致 tpa尿累积排泄率有较大个体差异，但尚需进一步研究证实。

【参考文献】 ［1］ 〖zk(#]xiao shuhua, wu huiming, marcel t, et al. tribendimidine: a promising, safe and broadspectrum anthelmintic agent from china［j］. acta tropica, 2005, 94(3):114.

［2］ 曹汉钧, 孙凤华, 钱益新, 等.新药三苯双脒治疗钩虫感染临床观察［j］. 中国寄生虫病防治杂志, 2000, 13(3):184186.

［3］ 吴中兴, 方悦怡, 刘宜升. 新药三苯双脒肠溶片治疗肠道线虫感染的效果观察［j］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2006, 24(1):2326.

［4］ yuan guiyan, wang benjie, wei chunmin, et al. lcms determination of p(1dimethylamino ethylimino)aniline: a metabolite of tribendimidine in human plasma［j］. chromatog, 2008, 68(7):139142.

［5］ 姚宏伟, 邱清, 吴仲华,等. 紫外分光光度法测定尿中对苯二甲酸［j］. 中华劳动卫生职业病杂志, 1995, 13(6):367368.

［6］ 戴建国, 王沐沂, 龚楠,等. 高效液相色谱法测定作业工人尿中对苯二甲酸含量［j］. 中国公共卫生, 1999, 15(9):844845.

［7］ 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题［j］. 药物分析杂志, 1996, 16(5):343346.

［8］ tremaine l m, quebbemann a j. the renal handling of terephthalic

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