痰液脱落细胞检查用什么瓶送检，痰脱落细胞学检测与诊断

今天中国论文网小编为大家分享毕业论文、职称论文、论文查重、论文范文、硕博论文库、论文写作格式等内容. 【摘要】 目的 通过检测痰液脱落细胞fhit基因微卫星不稳定性(microsatellite instability, msi)和杂合性缺失(loss of heterozygosity, loh)，评价fhit基因检测在肺癌早期诊断中的敏感性，探讨肺癌筛查的有效方法。方法 以液基细胞学为基础，采集并分离高危人群痰液脱落细胞，提取dna，检测fhit基因msi和loh。结果 在肺癌患者中出现msi或loh异常的阳性率在41.6%～49.5%之间，以d3s1300最高，达到49.5%，3个位点中至少1个位点出现微卫星异常为72.3%(n=73)，至少2个位点出现微卫星异常为45.5%(n=46)。统计学分析表明，fhit基因出现msi或loh在肺癌和非肺癌患者中的差异有统计学意义(p<0.05)。结论 以液基细胞学为基础，检测痰液脱落细胞fhit基因的msi和loh可以作为肺癌早期诊断的新途径。不同微卫星位点出现异常表现的具体形式有所不同，多位点联合检测可以提高诊断的敏感性和特异性。

【关键词】 液基细胞学 痰液标本 微卫星不稳定性 杂合性缺失 肺癌诊断

　　evaluation of fhit gene detection for early diagnosis　lung cancer in sputum specimen

　　zhuang penghui, jiang xiaogang, pan chengen, shang dong

　　1. department of thoracic surgery, the first affiliated hospital, medical school ofxian jiaotong university; 2. department of genetics and molecular biology, medical school ofxian jiaotong university; 3. department of geratic surgery, the first affiliated hospital,medical school of xian jiaotong university, 4. department of respiration,the first affiliated hospital, medical school of xian jiaotong university xian 710061, china

　　abstract: objective by detecting microsatellite instability (msi) and loss of heterozygosity (loh) in fhit gene in sputum specimen, we intended to evaluate the sensitivity of fhit gene detection to early diagnosis of lung cancer and explore effective method to screen lung cancer. methods based on liquidbased cytology, we collected and isolated sputum specimens in high risk group, abstracted dna, and detected msi and loh in fhit gene. results the positive rate of msi or loh at single locus was between 41.6% and 49.5%; the site d3s1300 was the highest and it was 49.5%. at least 1 site out of 3 sites that had abnormal microsatellite accounted for 72.3% in lung cancer patients, two sites that appeared to change accounted for 45.5%, which was significantly different compared to nonlung cancer patients (p<0.05). conclusion based on liquidbased cytology, detection of msi and loh in fhit gene in sputum specimen may be a means of screening lung cancer. different loci may have different abnormal appearance; combination detection in multilocus might raise sensitivity, which could provide new means for lung cancer screening.

　　key words: liquidbased cytology; sputum specimen; microsatellite instability; loss of heterozygosity; lung cancer diagnosis

　　fhit基因异常是肺癌演变中的一个早期、频发事件。大多数学者认为肺癌发生的基因变化顺序首先是3p等位基因(fhit)缺失或微卫星改变，随后依次为9p21杂合性缺失、myc基因过表达，8p2123、13q等位基因(rb)和17p杂合性缺失等。以上基因异常均发生在原位癌之前，之后才是5q21(apcmcc)杂合性缺失及kras癌基因突变[1]。因此，对fhit基因异常的检测可能对早期发现癌前病变、早期诊断及治疗具有重要意义。 　　检测微卫星异常的标本除了传统的肿瘤组织外，还有支气管灌洗液分离得到的细胞和痰液等。由于支气管镜检费用较高、痛苦较大、并发症较多，很难开展早期诊断的筛查。液基细胞学处理的痰液标本，可得到脱落细胞并去掉杂质。在我们先前的研究中，液基细胞学处理明显提高了痰液标本的诊断准确率和敏感性[2]，因此液基细胞学标本是很好的分子生物学研究平台，适合进行免疫组化和rtpcr分析等多种实验性研究。液基细胞学与分子生物学的结合将为临床肺癌筛查提供更客观、更早期的检查手段，对于提高肺癌早期诊断的检出率有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集西安交通大学医学院第一附属医院2006年2月至2006年9月临床送检的肺癌高危人群痰液标本287例。嘱患者在早晨排痰以后，留取上午8～9时的新鲜痰并及时送检。痰量很少或没有自然排痰者，可采用雾化吸入法促进排痰。每例患者连续送检3d。在287例痰液标本中,最终经纤维支气管镜活检或手术治疗得出病理诊断为肺癌的是101例。

　　1.2 标本处理

　　收集痰液于已消毒的50ml试管中，加入等体积标准固定液，双层消毒纱布过滤滤液，4℃ 2500r/min离心5min，沉淀物用pbs、ddh2o 2ml分别洗涤各2次(2500r/min离心5min)，沉淀物(即脱落细胞)冻存于-20℃冰箱或直接用于dna提取。

　　1.3 dna提取

　　脱落细胞按dna抽提试剂盒(wizardtm genomic dnapurification kit)说明书进行：取冻存的细胞置于37℃水浴中解冻5min；加入600μl核裂解液至细胞混悬液中，吹打至无细胞结块；加入3μl rna酶溶液至溶液中；加200μl蛋白沉淀液至上述溶液中；小心将上清液移至另一装有600μl室温异丙醇的离心管中，轻柔晃动试管，只至线状dna形成团线状；加600μl室温700ml/l乙醇至离心管中，轻柔颠倒几次以洗涤dna；加100μl dna再水合液溶解dna，4℃过夜溶解dna并保存备用。

　　1.4 微卫星引物

　　msi分析选用的3个微卫星位点及引物序列见表1。引物序列来自genbank，由上海生物工程技术服务有限公司合成。表1 3个微卫星位点及引物序列（略）

　　1.5 聚合酶链式反应

　　单链长度多态性(pcrsslp)分析 pcr反应体系体积为25μl。反应结束后，pcr产物部分进行15～20g/l琼脂糖凝胶电泳，以观察括增效果，之后进行80g/l变形聚丙烯酰胺凝胶电泳、显色和终止等步骤后封片。pcr试剂和变形聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂由上海生物工程技术服务公司。

　　1.6 msi和loh的判定

　　与marker比较，若某一微卫星位点的等位基因条带增多或位置发生改变，则记为msi；若某一微卫星位点的等位基因条带消失或相对密度减少50%以上记为loh。

　　1.7 统计学处理

　　全部数据均使用spss11.5软件进行统计学处理，msl和loh诊断肺癌的灵敏度和假阳性率的比较采用χ2检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 d3s1234位点的dna分析 　　　　在101例确诊肺癌患者中，出现msi有27例，占26.7%，出现loh的有18例，占17.8%，两者总和为45例，占44.6%；其他186例非肺癌患者中，出现msi有37例，占19.9%，出现loh的有8例，占4.3%，两者总和为44例，占24.2%。统计学分析表明，fhit基因出现msi或loh在肺癌组织和非肺癌组织中的差异有统计学差异(p<0.05)。

　　2.2 d3s1300位点的dna分析

　　在101例确诊肺癌患者中，出现msi有30例，占29.7%，出现loh的有20例，占19.8%，两者总和为50例，占49.5%；其他186例非肺癌患者中，出现msi有39例，占21.0%，出现loh的有10例，占5.4%，两者总和为49例，占26.3%。统计学分析表明fhit基因出现msi或loh在肺癌组织和非肺癌组织中的差异具有统计学差异(p<0.05)。

　　2.3 d3s1481位点的dna分析

　　在101例确诊肺癌患者中，出现msi有25例，占24.8%，出现loh的有17例，占16.8%，两者总和为42例，占41.6%；其他186例非肺癌患者中，出现msi有35例，占18.8%，出现loh的有7例，占3.8%，两者总和为42例，占22.6%。统计学分析表明，fhit基因出现msi或loh在肺癌组织和非肺癌组织中的差异具有统计学差异(p<0.05)。

　　2.4 两组患者3个位点msi、loh的比较

　　在101例确诊肺癌患者中出现msi或loh异常的阳性率在41.6%～49.5%之间，以d3s1300最高，达到49.5%；3个位点中至少1个位点出现微卫星异常为72.3%(n=73)，其中有45.5%(n=46)呈多位点的改变。在186例非肺癌患者中出现msi或loh异常的阳性率在22.6%～26.3%之间,以d3s1300最高，达到26.3%；3个位点中至少1个位点出现微卫星异常为30.6%(n=57)，其中至少2个位点出现微卫星异常为12.4%(n=23)。统计学分析表明fhit基因出现msi或loh在肺癌和非肺癌患者中有显著差异(p<0.05，图1)。

　　3 讨 论

　　肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的癌症[3]，其总体五年存活率仅13.9%。但是不同阶段的肺癌生存率差别很大，如晚期肺癌不能手术的5年生存率仅仅2%～3%；而早期肺癌，尤其是2cm以下的肺癌，5年存活率可达90%～100%[4]。至今肺癌尚缺乏有效的早期诊断方法，80%的患者确诊时已经是中晚期[5]。因此，早发现、早诊断已成为肺癌防治工作的重中之重，而早期诊断的关键是能否找到一种灵敏度高、特异性强的非创伤性诊断方法。 　　痰液细胞学的先行者geno saccomanno的研究表明，在肺癌高危人群得到临床诊断之前，痰液中就可以检测到恶变的细胞，但是对这些脱落细胞的监测，需要有经验的专业人员对其细胞核的变化做出准确的判断，因此这种方法无法在临床开展筛查。而液基细胞学的出现却为这一古老却行之有效的方法带来转机。

　　美国食品与药品监督管理局(fda)在1996年认证通过的新柏氏thinlayer gynecologic cytology test，可替代传统涂片，在检测鳞状上皮内瘤变方面，通过分割实验标本使其检出率比传统方法有极大的提高。我们对此已经做了初步的研究，相关的研究成果已经发表[2]。之后的研究表明，在这个平台上继续应用分子生物学方法，将会取得更大的成果[6]。

　　微卫星异常在不同的染色体上发生的频率不同。有研究者对已知的13个肿瘤抑制基因(fhit、vhl、apc、prlts、p16、ifna、pten、p57、atm、p53、brca1、dpc4和dcc)进行了研究，结果表明fhit、p16、p53、ifna、vhl的loh在非小细胞肺癌中均高度频发，而其他基因的微卫星异常发生频率很低。肺癌在发生过程中要经历不同的阶段，包括良性增生、癌前病变、原位癌、侵润癌、转移癌。近年研究认为，在癌前病变阶段，先出现3p部分某些等位基因丢失，其中3p14.2(fhit基因)等位基因缺失常见[7]。研究表明，fhit的3个位点d3s1234、d3s1300、d3s1481在异型性增生中广泛存在[89]，而在良性增生中微乎其微(p<0.01)，体现出良恶性病变的区别，同时也说明fhit基因的微卫星异常是肺癌发展的早期重要因素。因此，本研究对这3个位点做了进一步的研究。

　　本研究结果表明，在确诊的肺癌患者中出现msi或loh异常的阳性率在41.6%～49.5%之间,以d3s1300最高，达到49.5%；3个位点中至少1个位点出现微卫星异常为72.3%(n=73)，其中至少两个位点出现微卫星异常为45.5%(n=46)。统计学分析表明，fhit基因出现msi或loh在肺癌和非肺癌患者中有显著差异(p<0.05)。因此，以液基细胞学为基础，检测痰液脱落细胞fhit基因的msi和loh可以作为肺癌早期诊断的新途径；不同微卫星位点出现异常表现的具体形式有所不同，多位点联合检测可以提高诊断的敏感性和特异性。本研究为开展肺癌筛查提供了新的方法。

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