血管性血友病因子活性偏高，血管性血友病凝血因子

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【摘要】 目的 研究血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）对胃癌细胞bgc823增殖和黏附的影响，并初步探讨相关机制。方法 体外培养人胃癌细胞株bgc823，以vwf抗体（vwf ab）处理；噻唑蓝比色（mtt）法检测细胞增殖活性和细胞黏附能力的变化；用倒置显微镜观察细胞形态学变化。 结果 vwf ab能够抑制 bgc823细胞的增殖，抑制作用呈剂量及时间依赖性；细胞形态学观察vwf ab作用对细胞生长具有明显的细胞毒作用；mtt黏附实验结果显示vwf ab处理后细胞的黏附率较对照组明显下降（p＜0.05），ⅳ型胶原高浓度组较低浓度组细胞黏附率增大（p＜0.01）。结论 vwf在体外能够影响胃癌细胞bgc823的增殖，并诱导细胞形态改变，促进细胞与细胞外基质的黏附。

【关键词】 vwf；胃癌细胞；增殖；黏附

effect of von willebrand factor on proliferation and adhesion of human gastric cancer cell line bgc823 in vitro

wang min, zhang hong, yang aijun, liu wei, wang chenyu, li min

institute of pathology, school of basic medicine, lanzhou university, lanzhou 730000, china

corresponding author: li min, email: limin0606@tract：objective to investigate the effect on proliferation and adhesion of vwf in human gastric cancer cell line bgc823 in vitro, and to clarify its probable mechanism. methods human gastric cancer cell line bgc823 cultured in vitro was treated with vwf antibody (vwf ab).the effect of vwf on the proliferation and adhesion of bgc823 in vitro was detected respectively by mtt colorimetric assay. the cell morphological changes were observed with inverted microscope. results vwf ab inhibited the proliferation of bgc823 in a timeand concentrationdependent manner. significant cytotoxicity of vwf ab on bgc823 cells was observed by cell morphology. compared with the control group, the adhesion ability of the bgc823 cells was decreased significantly (p<0.01) after treatment with vwf antibody. conclusion vwf has significant effect on the proliferation of bgc823 cells and the cell morphological change in vitro, vwf takes an important part in the progress of adhesion on the bgc823 cells.

key words：vwf; gastric cell; proliferation; adhesion

血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）是一种由血管内皮细胞及巨核细胞合成和释放的大分子糖蛋白，生理状态下参与凝血的发生。目前研究［1］表明与肿瘤的转移关系密切，但对其机制的研究报道较少。为了探索vwf对于肿瘤发生、发展及其恶性生物学行为的影响，本研究通过体外培养胃癌细胞bgc823，采用vwf抗体进行干预，观察vwf对肿瘤细胞增殖和黏附能力的影响，并初步探讨其作用机制，为vwf临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

rpmi1640（美国gibco公司）；胰酶（美国amresco公司）；超级新生牛血清（fbs）（杭州四季青生物工程有限公司）；ⅳ型胶原，兰州大学病理研究所自制；四甲基偶氮唑蓝 （mtt）及牛血清白蛋白（bsa）（美国sigma公司）；兔抗人vwf多克隆抗体（ab6994，abcam公司）；人胃癌细胞株bgc823购于中国科学院上海细胞生物研究所，经预实验检测显示能够表达vwf。

1.2 细胞培养

用含10 ％灭活新生牛血清的rpmi1640 培养液（含100ku/l青霉素, 100ku/l链霉素）在37℃、

5％ co2及饱和湿度的培养箱中维持培养。

1.3 mtt法测定vwf ab对bgc823细胞增殖的影响

bgc823细胞以5×105／ml的密度接种于96孔板中，同时每孔加vwf ab，根据预实验结果使其终浓度分别为0、5、10、20μg／ml，每个浓度平行3孔，对照组加入等体积培养液，置co2培养箱培养。分别于24、48、72h后取出96孔板，弃上清，加200μl／孔无血清rpmi1640及20μl／孔mtt，4h后弃上清，加200μl／孔二甲基亚砜（dmso）震荡10min混匀，待溶解完全后用酶标仪測a570值。细胞增殖抑制率计算公式如下：细胞增殖抑制率（ir％）＝（1－实验组a570／对照组a570）×100％。

1.4 细胞形态学观察

bgc823细胞以5×104／孔的密度接种于6孔培养板内，对照组无干预，常规培养；处理组在培养基中加入vwf ab 20μg/ml；每组3个复孔。24、48、72h时分别于倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。

1. 5 黏附抗体抑制实验

将vwf ab（20μg/ml）加于rpmi1640培养基中，与bgc823细胞共培养48h；将96孔板预先分别用3g／ml及1.5g／ml ⅳ型胶原20μl／孔包被，2％ bsa封板处理，加入调好的细胞悬液200μl／孔（5×105／ml）；co2培养箱分别孵育30、60、90、120min后，弃去培养液，pbs冲洗除去未黏附细胞；弃pbs后加入mtt 20μl，及无血清rpmi1640 200μl，co2孵育3h；吸弃培养孔内上清液，加入dmso 200μl溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪570nm测各孔吸光度（a570）值，同时设立相应的rpmi1640培养对照组。各组重复3次。

1.6 统计学方法

采用spss 11.5统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间差异比较采用方差分析和kruskalwillis检验， p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 vwf ab对bgc823细胞增殖的影响

mtt法检测结果显示bgc823细胞的生长受到明显的抑制，随着作用时间延长，抗体浓度增大，增殖抑制率增加，表明抑制作用与浓度和作用时间均呈明显的依赖关系，见表1。表1 vwf ab对bgc823细胞增殖的抑制率 同一时间不同浓度比较，*： p＜0.05；不同时间同一浓度比较， #：p＜0.012.2 vwf ab对bgc823细胞形态的影响

对照组bgc823细胞无形态学改变，呈上皮型贴壁生长，多呈纺锤形、多边形，少数呈长梭形，细胞轮廓清晰，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，细胞核异型性明显，核仁清楚，细胞质丰富。vwf ab处理48h时细胞分布较对照组稀疏，细胞呈纤维样生长，伪足较长，细胞核及细胞质轮廓折射增强，较粗糙，部分细胞不再贴壁生长，悬浮于培养液中；处理72h时细胞形态失常，胞体变圆和不规则、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢，细胞周围出现碎片，部分细胞死亡后漂浮在培养液中，见图1。

2.3 vwf ab对bgc823细胞与细胞外基质成分ⅳ型胶原黏附能力的影响

经 vwf ab作用细胞48h后，随着时间延长（30、60、90、120min），bgc823细胞在ⅳ型胶原上的黏附增加（p＜0.01），差异有统计学意义；vwf ab处理组与对照组比较，细胞在各时间点上黏附明显下降（p＜0.05），差异有统计学意义；ⅳ型胶原。

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，涉及多种因素的相互作用。oleksowicz等[2]首次报道伴有血道转移的恶性肿瘤患者血浆vwf水平增高；eppert等[3] 研究发现骨肉瘤患者发生远处转移时，转移灶中vwf含量增高；相反terraube等[4]研究发现在vwf基因缺陷小鼠，黑色素瘤自发性肺转移的转移潜能增加。但是在胃癌中，尚没有相关的研究报道，我们推测vwf也参与了胃癌的发生发展。

我们的研究表明，vwf ab能有效抑制胃癌细胞bgc823的增殖，细胞增殖抑制率随作用时间的延长和浓度增加而增高，具有时间和剂量双依赖性，提示vwf 除了在正常生理状态下参与凝血过程的发生外，亦能够影响胃癌细胞bgc823的增殖，在胃癌的发生中发挥重要作用。同时通过细胞形态学观察发现，经vwf ab处理后，细胞形态失常，推测vwf可能通过影响细胞的形态，进而改变肿瘤细胞自身的黏附、迁移相关特性，影响肿瘤的转移。

肿瘤细胞的黏附性在其侵袭和转移中起着极为重要的作用[5]。terraube等[4]研究表明黑色素瘤细胞能与vwf发生黏附，呈时间依赖性；noelia 等[6]研究表明vwf抗体能够抑制乳腺癌细胞与细胞外基质的黏附。我们的实验结果证实：用抗vwf抗体阻抗vwf作用后，bgc823细胞与细胞外基质的主要组成成分－ⅳ型胶原的黏附能力降低，提示了vwf能够促进胃癌细胞bgc823与基质成分的黏附，推测vwf可能与肿瘤细胞直接黏附，或与肿瘤细胞表面相关黏附分子黏附，通过其“桥梁”作用，促进肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，进而改变侵袭、迁移相关性质，促进肿瘤的转移，其具体作用机制还需进一步的研究。

同时，随着时间延长，细胞的黏附率增加，表明肿瘤细胞与细胞外基质的黏附呈时间依赖性。此外，随着ⅳ型胶原浓度升高，bgc823细胞相应的黏附能力增高，提示ⅳ型胶原能够诱导肿瘤细胞的黏附，呈剂量依赖性，这与胡劲松等［7］关于ⅳ型胶原可通过诱导肿瘤细胞黏附和迁移，从而促进肿瘤细胞浸润和转移的实验报道相一致，进一步表明肿瘤细胞的黏附能力受到多因素、多水平的调节。

综上所述，本实验研究证实了vwf在体外能够影响胃癌细胞bgc823的增殖，并诱导细胞形态改变；同时能够促进细胞与细胞外基质的黏附，在肿瘤的转移中发挥重要作用。

【参考文献】 ［1］ wei sw, jen kl, tzu cl, et al. plasma von willebrand factor level as a prognostic indicator of patients with metastasis colorectal carcinoma[j]. world j gastroenterol, 2005, 11(14):21662170.［2］ oleksowicz l, bhagwati n, deleonfernandez m. deficient activity of von willebrand’s factorcleaving protease in patients with disseminated malignancies[j]. cancer res, 1999, 59（9）:22442250.［3］ eppert k, jay s, aneliunas v, et willebrand factor expression in osteosarcoma metastasis[j]. modern pathology, 2005, 18（3）: 388397.［4］ terraube v, pendu r, baruch d, et al. increased metastatic potential of tumor cells in von willebrand factordeficient mice[j]. j thromb haemost, 2006, 4（3）: 519526.［5］ sass involvement of selections in cell adhesion,tumor progression, and metastasis[j]. cancer investigation, 1998, 16（5）:322328.

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