【摘要】 目的建立大鼠脑中清脑宣窍方有效部位中3个指标性成分栀子苷、人参皂苷rg1、rb1的hplc浓度测定方法。方法大鼠脑样品取出，洗去残血、匀浆、甲醇提取、离心后水溶，用c18固相萃取柱处理，以亥茅酚苷为内标，选用色谱柱：agilent eclipse xdb-c18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，eclipse xdb-c18保护柱。流动相为乙腈-甲酸水二元梯度洗脱，柱温为30℃，流速为1.0 ml/min，检测波长为203 nm。结果各成分的最低检测限(s/n>3)在0.16～1.1 mg/l之间,平均回收率均在90%以上,日内、日间精密度及稳定性的rsd均小于10%。结论该方法简便、准确，可用于脑组织中清脑宣窍方有效部位栀子苷、人参皂苷rg1、rb1 3种成分定量分析。
【关键词】 清脑宣窍方; 栀子苷; 人参皂苷rg1; 人参皂苷rb1; 高效液相色谱
quantitative determination of 3 main components in effective fraction of qingnaoxuanqiao formula in sd rat brain by rp-hplc
abstract:objectiveto establish a method for determination of the concentrations in rat brains of geniposide, ginsenoside rg1 and ginsenoside rb1 by hplc in the effective fraction of qingnaoxuanqiao formula. methodsthe rat brain samples were taken out, cleaned remaining blood, smashed into plasm , extracted by meoh, and dissolved by water after centrifuging. a column of c18 solid phase was used for the extraction and sec-o-glucosylhamaudol was taken as internal standard. the procedure was carried out on a chromatography column of agilent eclipse xdb-c18 chromatography column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) and a protective column of eclipse xdb-c18. the mobile phase was a binary gradient elution of ethane nitrile to acid water and the column temperature was 30℃. the flow rate was 1. 0 ml /min and the detection wavelength was 203 sthe lowest testing concentration of each constituent ( s/n > 3) was from 0. 16 to 1. 1 mg/l. the average recovery was above 90%. rsds of accuracy and stability in intra-day and inter-day were all below 10%. conclusionthe method is easy and accurate, which can be used in the quantitative analysis of 3 constituents in the effective fraction of qingnaoxuanqiao formula in brain tissue.
key words:qingnaoxuanqiao formula; geniposide; ginsenoside rg1; ginsenoside rb1; hplc
清脑宣窍方为王永炎院士救治脑中风临床经验方，由栀子、三七等中药组成。本方及其有效部位具有清热解毒、宣窍活络的作用，对于缺血性脑中风具有显著的疗效[1,2]。栀子苷，人参皂苷rg1，rb1为该方主要药效成分[3,4]。为了解其在体内的分布及代谢情况,本文建立了hplc同时测定清脑宣窍方有效部位中3种成分在脑组织中的浓度测定方法。
1 仪器与试药
waters 2695高效液相色谱仪，2696dad检测器，自动进样，sartorious bt 25s型1/100000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，kq-500de型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);ql-901漩涡混和机(其林贝尔仪器制造公司);cleanert c18 spe固相萃取柱(3 ml，200 mg，60 μm，北京艾杰尔科技有限公司)。
栀子苷，人参皂苷rg1、rb1对照品(批号分别为：110749-200309，110703-200322，110745-200312)购自中国药品生物制品检定所，亥茅酚苷对照品由北京中医药大学药化室提供。
清脑宣窍有效组分(由栀子和三七药材混合提取再经大孔树脂富集后按比例加入天然冰片制备而成，自制)。乙腈(fisher公司)，色谱纯;屈臣氏重蒸水;其他试剂均为分析纯。
sd大鼠,体质量为(300±10)g，雄鼠(由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供)。
2 方法与结果
2.1 给药方法及脏器处理健康sd大鼠，用药前禁食18 h，单剂量灌服清脑宣窍有效部位(6 g/kg),于给药后60 min取出脑，生理盐水浸泡,洗去残留血液,-40℃保存备用。
2.2 对照品溶液和内标溶液的制备精密称取栀子苷，人参皂苷rg1、rb1对照品，置25 ml量瓶中，加水制成一定浓度混合对照品储备液，临用时，用水稀释成标准系列浓度的对照品混合溶液;精密称取亥茅酚苷5 mg，置100 ml量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.05 g/l的内标溶液。
2.3 心脏样品处理取单个心脏，吸干水分，精密称重，加入重量两倍体积的生理盐水，以18 000 r/min匀浆。匀浆液加入两倍体积的分析甲醇及0.025 ml内标,涡旋振荡10 min,混合液在6 000 r/min下离心20 min,取出上清液，残渣再加入两倍体积甲醇，漩涡振荡10 min, 6 000 r/min下离心20 min,两次上清液混合,常温减压回收至干。残渣用5 ml液相水溶解，超声振荡，上spe固相萃取柱，先用水洗脱3 ml，再用甲醇洗脱2 ml，收集甲醇洗脱液，常温减压干燥，残渣加甲醇300 μl漩涡溶解，即得供试品溶液。
2.4 色谱条件及系统适应性
2.4.1 色谱条件色谱柱为agilent eclipse xdb-c18(4.6 mm×250 mm，5 μm);保护柱：eclipse xdb-c18;柱温30℃;流速1.0 ml/min;检测波长203，238 nm;洗脱梯度：乙腈(a)-甲酸水(b)：5%a17 min→16%a 23 min→ 16%a 28 min→ 20%a 34 min→ 22%a 50 min→ 30%a 65 min→ 45%a 80 min→100%a
2.4.2 检测波长的选择取清脑宣窍方有效部位适量，用甲醇稀释后，以甲醇为空白，在200～400 nm范围扫描测定紫外吸收光谱，结果样品在该范围内有两个明显的吸收峰，最大吸收波长分别为203，238 nm。结果见图1。
图1 清脑宣窍方有效部位紫外吸收图
精密吸取10 μl栀子合三七供试品溶液注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件分别在203 nm及238 nm检测，结果在203 nm波长下，基本包括了238 nm波长下所有色谱峰。因此，确定203 nm为清脑宣窍方供试品溶液hplc紫外检测波长。
2.4.3 系统适应性在上述条件下分别精密吸取对照品混合溶液(包括内标);空白心;空白心加对照品及含药脏器供试品溶液各10 μl，进样测定。结果表明在对照品溶液和含药脏器供试品溶液色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，且空白心脏样品无干扰。结果见图2。
2.5 标准曲线制备及最低检测限测定取空白脑，按“2.3”项下方法取材并匀浆后,分别加入7个高低不同浓度混合对照品溶液各5份,而后按“2.3”项下方法同量加入甲醇沉淀蛋白，混匀、离心并回收上清液至干,5 ml屈臣氏水溶解,并通过固相萃取柱，水、甲醇依次按量洗脱，甲醇洗脱液蒸干，300 μl甲醇涡旋溶解成供试液。以各对照品色谱峰峰面积as与内标色谱峰峰面积ai比值as/ai为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程及定量限(loq)，再以信噪比(s/n〉3)分别测得最低检测限(lod)。结果见表1。表1 标准曲线制备及最低检测限确定
2.6 精密度实验取空白脑脏器液，加入混合对照品溶液0.1 ml，制成高、中、低3个浓度的样品，按“2.3”项下方法处理后，日内每个浓度测定5次，测定各对照品峰面积as及内标峰面积ai，通过峰面积比值as/ai计算各对照品的组织浓度及rsd，结果表明日内精密度良好;连续测定5 d,同法计算各对照品的浓度及rsd，结果表明日间精密度良好。结果见表2。
2.7 脑组织回收率实验取空白脑匀浆液，加入混合对照品溶液0.1 ml，制成高、中、低3个浓度的脑样品，每个浓度各5份，按“2.3”项下方法操作，测定对照品峰面积as和内标峰面积ai，计算比值as/ai，标准曲线法计算浓度，所得浓度与实际浓度比值即为方法回收率;测得各对照品峰面积与相应浓度对照品峰面积的比值，即为萃取回收率。结果见表3。
2.8 脑组织稳定性实验取一定量空白脑匀浆液，按比例加入混合对照品溶液，制成高、中、低3个浓度样品，每个浓度分成2份，1份室温放置，另1份于-40℃条件下保存。取室温样品，每隔1 h吸取5 ml，按“2.3”项下方法操作，测定各对照品峰面积as及内标峰面积ai，通过峰面积比值as/ai计算各对照品的脑组织浓度及rsd，结果表明心脏匀浆液样品室温放置5 h稳定性良好;取冷冻脏器样品，解冻后按上述方法处理测定，再冷冻，10 d内依法测定3次，结果表明心脏样品冻融稳定性良好，且样品在-40℃条件下保存10 d基本稳定。结果见表4。表2 脑组织精密度实验表3 脑组织回收率实验表4 脑组织稳定性实验
2.9 清脑宣窍方脑样品含量测定取6 g/kg给药后60 min脑样品，按“2.3”项下方法操作，吸取10 μl进样，以随行的标准曲线计算浓度。结果见表5。表5 60 min脑组织样品含量测定结果
3 讨论
生物样品含有许多内源性的杂质，脏器组织含有大量的蛋白质、脂肪、核酸等成分，在测定过程中能形成泡沫、浑浊或沉淀，并且有时还会与加入的试剂反应，从而干扰分析;蛋白质等还会污染仪器和恶化测定条件，如果直接进样用液相色谱分析含蛋白的体液样品时，蛋白质会逐渐沉结在色谱柱上，影响柱效，导致柱压上升，最终无法使用，所以脏器样品必须进行合理的前处理;另外，有效成分可以跨膜转运至组织细胞内，也可存在于组织液中，在测定前组织必须粉碎，才能使有效化学成分能充分溶出，得到确定结果。我们对脏器在前处理过程上总结出以下方法：匀浆，有机试剂沉淀蛋白，高速离心分离沉淀物，回收有机试剂，c18 spe固相萃取柱处理等步骤。实验证明，该方法操作简单，回收率合适，是一种有效的脏器前处理方法。
生物样品用色谱法分析时通常要采用纯化，浓缩等预处理，而各步骤操作又难以做到完全的平行一致，所以生物样品一般均采用内标法定量。根据选择内标的最基本的原则，我们曾考察了芍药苷、橙皮苷、亥茅酚苷等化合物，最后选择了亥茅酚苷，其在色谱图中出峰时间与人参皂苷rg1接近，并且在血清样品的前处理过程中保留行为与四成分相似，回收率大于85%。
清脑宣窍方有效成分中栀子苷对心脏作用表现为降低心肌收缩力[5];人参皂苷rb1对心肌收缩有抑制作用[6];人参皂苷rg1对大鼠心肌细胞l、t型钙通道有阻滞作用[7]。本次实验证明,脑中均能通过液相检测到该种成分，为研究提供了一定的依据。
本文建立了hplc法同时测定清脑宣窍方中3种成分的脑浓度方法。测定结果表明,建立的方法准确可靠、灵敏度高,可较好地用于清脑宣窍方脑组织药代动力学研究。
【参考文献】
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