作者：李力， 徐永莉， 张月云， 赵成坚
【摘要】 目的对dna分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的应用作一综述。方法通过查阅20世纪90年代以来发表的文献进行归纳分析。结果dna分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点；使用较多的方法主要有rapd、issr、its标记以及rrna基因序列分析技术。同时，dna分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高、对不同部位入药的药材仍然难以区分以及无法用于成药、复方、提取液鉴定等弱点。结论dna分子遗传标记作为中药材鉴定的方法还有待发展和完善。
【关键词】 dna分子遗传标记； 中药材； 鉴定
abstract：objectivethe paper summarizes the researches of application of dna molecular markers in chinese medicinal sinduction and analysis were used by referring to literature released since 1990s . resultsdna marker technologies have characteristics of trace,rapid,peculiarity, accuracy and credibility, lower requirements for the sample. random amplified polymorphic dna (rapd),inter-simple sequence repeat (issr), interial transcribed spaoers (its) and rrna gene sequencing technology are often r, dna marker technologies have some disadvantages that employees are required special skills,the cost is high and the technique is complicated,while it is difficult to distinguish different parts of chinese medicinal materia used medicinally and identify patent medicine, chinese medicine complex prescription and the extract of chinese medicinal materia. conclusionthe methods of chinese medicinal materia identification by dna molecular markers need to develop and improve.
key words：dna molecular marker； chinese medicinal materials； identification
针对我国药材种类繁多,来源复杂且品种混淆情况严重的状况, 为了保证临床用药的安全及质量和疗效,广大中医药领域的专家学者多年来一直都致力于寻找更加科学的鉴定方法来解决这一难题。随着当今生命科学不断取得重大突破, 其中分子生物学技术以其准确性高、重复性好等特点尤为引人瞩目。dna分子标记大致可分3类:首先是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术,其中代表技术有rflp分子标记技术；第2类是以电泳技术和pcr技术为核心的分子标记技术,实际使用较多的代表技术为:rapd、简单序列重复间区标记技术(inter-simple sequence repeat issr)和aflp(amplified restriction fragment polymorphism)。第3类是以dna序列为核心的分子标记技术,其代表性技术有its(interial transcribed spaoers)测序分析技术。本文仅就最近十几年来dna分子标记技术在中药鉴定方面的应用作一分析， 并就其应用前景进行讨论和展望。
1 经典的dna分子标记技术
此类技术的代表是限制性片断长度多态性 (restriction fragment length polymorphism，rflp)。
rflp是最早发展的分子标记，是由bostein首先提出，soller和beckman最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定，这是最早发展的分子标记技术。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组dna后，与同位素或非同位素探针标记杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。rflp探针的来源主要是rg克隆和cdna克隆，其中cdna探针保守性较强，许多同科物种cdna探针都可以作为通用探针。在实际应用过程中，人们普遍感到经典的rflp技术须经酶切、电泳、southern转移、与探针杂交、放射自显影等步骤, 在实际应用中很不方便，费时费力,并受到探针来源的限制，多态性检出效率低(只能检测探针长度内切酶识别位点上的变异)。同时要求的dna量较大,实验材料必须新鲜, 因此难以适用于干燥药材的鉴定,目前在中药鉴定领域已很少使用,已归为被淘汰的技术。
在多源性中药材如伞形科北沙参、柴胡,菊科苍术属豆科甘草属,羽扇豆属（lupinus sp．），yamazaki m,茄科澳茄属(duborsia s ) mizukami h,3种苍术mizukami h的基原鉴定、资源分析及其地理品系(居群)间亲缘关系研究方面有了一些报道。
2 基于pcr的dna分子标记技术
此类标记技术的代表为:rapd（random amplified polymorphic dna)、简单序列重复间区标记技术(inter-simple sequence repeat issr)和aflp(amplified restriction fragment polymorphism)。
2.1 随机扩增片段长度多态性标记(random amplified polymorphic dna，rapd)rapd技术是由美国的williams与welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种dna分子标记技术。williams等称之为rapd，welsh等称之为ap-pcr(arbitarily primed pcr)，此技术利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组dna进行pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测dna序列多态性。rapd标记只需微量dna,且对受试基因组无特定要求(不须知道受试基因dna的背景材料),检测灵敏、方便、多态性强，可以检测出rflp标记不能检测的重复顺序，可填补rflp图谱空缺，适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究，也可用于亲缘关系等的研究。相对于其他几种分子标记, rapd标记是在中药鉴定领域用得最多的分子遗传标记技术, 并对中药鉴定研究产生了深刻的影响。rapd技术自问世以来 ，在中药鉴定中主要用于中药混淆品、代用品的鉴定,多来源中药的鉴定,名贵中药的鉴定,动物类中药的鉴定等。
从1996年以来，黄璐琦等［1～3］等分别对天花粉、西洋参等进行了鉴别研究，证明了rapd分析法作为鉴别动植物类生药是可行的。
2000～2004年，于燕莉等［4～13］分别对金银花、姜黄属药材和山药、射干类药材射干及混淆品鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾、近缘物种金线莲母(金线莲) 与金线莲公(无线金线莲)、泽泻、麻黄、灵芝、厚朴、地黄和海风藤等进行了研究,从分子水平定性地揭示道地药材的遗传变异,得出同种异地药材所形成的不同的居群，具有不同的遗传特征。李颖等［14］分别对广藿香和独活药材进行探索, 并建立了鉴别方法。
2.2 aflp技术扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, aflp)标记技术是1993年由荷兰科学家zabeau和vos发展起来的一种检测dna多态性的方法， aflp是一种rflp与rapd相结合而又不使用分子杂交技术的分子标记手段，被誉为新一代的分子标记技术。它的原理是基于对基因组dna双酶切经pcr扩增后的限制片段进行选择。使用特定的双链接头与酶切dna片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板dna进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，所以，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可以被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上的dna指纹的有无来检出多态性。由于aflp预先不需要知道dna序列的情况，但获得的指纹信息位点要比rapd技术更为丰富。相比之下。最后完成aflp实验的成本比用rapd方法的成本低，更省时间、更方便，而且准确性更高，数据更可靠，技术难度也不大。
2000年以来，马小军等［15～19］用aflp标记分别对人参、西洋参、石斛以及天麻等进行分析，结果显示，aflp指纹技术具有稳定性高、重复性好等优点，得到了清晰的aflp指纹图谱，该体系具有良好的稳定性和重复性。
2.3 issr标记技术简单序列重复区间（inter-simple sequence repeat，issr）技术又称为锚定简单序列重复技术（anchored simple sequence repeat，assr）由加拿大蒙特利尔大学的zietkiewicz等于1994年提出。它用锚定的微卫星dna为引物，即在ssr序列的3’端或5’端加上2～4个随机核苷酸，在pcr中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间dna片段进行pcr扩增。所扩增interssr区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表。issr标记技术特点：实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。issr标记技术结合了rapd标记技术和ssr标记技术的优点，耗资少，模板dna用量也少。
2003年以来，此标记技术受到许多学者的青睐，邱英雄等［20～31］分别对明党参和川明参、南北五味子、罗汉果、金花茶、怀区地黄、铁皮石斛和黄精、麦冬、金钗石斛、丹参和半夏等药材的基因组dna进行pcr扩增，建立并优化了issr-pcr反应体系，结果证明issr标记可以作为不同产地药材鉴别的有效分子标记。
此外，2008年以来，李磊等［32～36］分别对4种叶型性状半夏和掌叶半夏、山茱萸、银杏、益智和乌头等药材利用issr分子标记进行了分析，并取得良好结果。
2.4 dna序列分析技术以dna序列为核心的分子标记技术。建立在pcr技术基础之上的dna测序分析技术(dna sequencing)的开发使dna分子标记技术取得了又一次的突破性进展。
动植物在进化过程中，其基因会发生碱基的重排、替代等，从而导致基因序列的差异。通过检测其dna片段序列的差异，即可将不同的种区别开来。近年来，由于dna测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化规律认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列，可以为pcr引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于pcr的dna直接测序技术，极大地提高了dna序列分析的效率，促进了该项技术的应用研究。目前用于中药dna测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcl，mat k rpoc 等；植物核基因组的rrna、its等；动物线粒体基因组cytb基因等 ，这些被选基因的共同特点是进化速率差异大，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘关系与进化等。
马小军等［37～40］2005年分别通过测定山参、大戟、巴戟天以及细辛和柴胡的序列，获得了可喜的效果 。
此外，徐红等［41～47］2004年分别对川芎、西洋参、竹节参、石斛、姜黄、大黄、当归及小秦艽、肉苁蓉、广藿香、太子参、葛根等进行了药材鉴别，根据序列能够将研究对象区别开。
动物类药材多用线粒体细胞色素b基因片段的序列变异鉴别药材。1998年吴平［48］通过分析对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12s rrna基因片段序列来区分正品和混淆品；还通过扩增约450bp的12s rrna和约490 bp的cytb基因片段对海马作了dna序列分析，可作为其它动物药材干样品鉴定的参考。1999年王义权等［49］扩增了乌梢蛇及其混淆品的cytb基因片段，通过比较蛇的cytb基因246 bp的同源dna序列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。
3 评价与展望
3.1 评价中药材品质鉴定是中药质量控制的首要环节，多年来人们一直在寻找科学有效的鉴定中药材的方法，从应用的现状不难看出dna分子标记技术在该领域的应用已经取得了一些成绩。dna分子标记技术作为中药材品质鉴定方法之一具有以下几点优势：微量、快速、特异性强、准确可靠，且不受药材生长发育阶段、供试部位、环境条件、产地、采收季节、贮藏等因素的影响，对样本要求较低，无论是药材还是成药、甚至是粉末都可以用来鉴别；归纳起来dna分子标记技术已应用于几个方面：①用于中药真伪、近缘药材及代用品鉴别，使用的方法主要有rflp，rapd，ap-pcr，its等标记；②药材的野生类型与栽培品种的研究，使用的方法主要有rapd，aflp；③粉末、中成药鉴别，使用的方法主要有rapd，rt-pcr；④本草考证与出土中药研究，使用的方法主要是测序技术；⑤道地药材研究，使用的方法主要有rapd，rflp ，aflp标记和its与rrna基因序列分析技术。文献报道的研究人员主要集中在中国、日本，但已显示了强劲的发展势头。另一方面，dna分子标记技术在中药材鉴定中的应用也存在着明显的不足。主要表现在几个方面：①作为鉴别药材的方法学的研究，投入的人力物力都还很有限，与中药其他方面研究的结合还未开展，所以从方法学上来讲，中药材的分子鉴定方法还需要发展才是。②使用还很局限，由于分子标记技术对实验室硬件和从业人员的技术要求很高，再加上成本也较高，所以真正用于中药材鉴别的方法还很少，已涉及的中药品种也很有限，从文中可看出，仅rapd、issr以及测序技术使用较多，涉及的中药品种也只有几十种；正因为技术复杂度的制约，此类鉴别技术对于生产收购第一线的人员仍然显得复杂，还无法推广使用。③数据分析所使用的软件还很局限，测序后对数据进行分析，这是判断药物近缘关系的关键步骤，数据分析必须借助多种软件及适当的方法，以往多采用的nei(1972)方法现已显单一了，目前用于其他生物技术的分析软件早已多元化了,且很多新的软件主要应用于中药材的遗传多样性分析当中。④dna分子标记技术对不同部位入药的药材仍然难以区分，各部具有同样dna标记式样。对于成药、复方、提取液的dna标记还未见报道。
3.2 展望从分子标记技术的发展来看，前后也就二十多年的时间，它也是随着分子生物学技术及信息技术的发展而发展的，不可否认的是分子标记技术肯定是本世纪的主流技术。除了以上分子标记技术外，现在还发展有单核苷酸多态性标记技术（snp）、相关序列扩增多态性标记技术（srap）、靶位区域扩增多态性标记技术（trap）、荧光原位杂交技术（fish）、变性梯度凝胶电泳技术（dgge）等［50］，这些技术已被用于其它一些领域的研究之中，因此，作为方法学的研究，在中药鉴定领域还应该加大人力物力的投入，选择和发展出更适合中药鉴定或针对不同鉴定对象的鉴定方法，最终推动分子生物学技术对更多的中药品种或剂型进行鉴定。同时我们也看到，仅仅依靠分子标记技术在相当长的时期内还不可能解决中药材和中药制剂的鉴定和质量控制，那么我们就还必须要同时选择多种方法进行协同分析，比如分子标记技术与细胞学标记技术、生化标记技术、高效液相及核磁共振分析等技术的协同使用，通过多种技术的结合来达到最终准确鉴定中药材或中药复方制剂的目的。
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