健肾解毒腹膜透析液（Ⅲ）指纹图谱的建立

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作者：王二丽， 陈丹，包国荣，林奇泗

【摘要】 目的运用中医药理论和现代色谱分析技术，研究建立健肾解毒腹膜透析液(ⅲ) hplc-elsd指纹图谱分析方法，为安全有效地控制其质量提供实验依据。方法选择li chro cart hplc-kartusche rp-18e色谱柱，柱温25℃，以流动相 a=乙腈，b=水组成的梯度洗脱系统，流速0.8 ml／min，elsd参数漂移管温度106℃， 氮气流速3.00 ml/min。结果建立了健肾解毒腹膜透析液（ⅲ）的指纹图谱。结论所建立的健肾解毒腹膜透析液(ⅲ) hplc—elsd指纹图谱分析方法，可有效地控制其质量，为研制安全有效的健肾解毒腹膜透析液提供了新的实验基础。

【关键词】 健肾解毒腹膜透析液(jspds(ⅲ))； 黄芪； 高效液相色谱法； 指纹图谱

　　abstract：objectiveto establish the chromatographic fingerprint diagram of jianshenjiedu peritoneal dialysis solution(jspds(ⅲ))under the theoretical guide of chinese traditional medicine．methodsgradient elution mode was applied in the chromatographic separation as its key procedure．the stationary phase used was lichro cart hplckartusche rp18e mobile phase a was acetonitrile，mobile pohase b was water．the flow rate was 0.8ml／min．the detection was madeby elsd．the column temperature was 25℃．resultsthe method of jspds(ⅲ) chromatographic fingerprint diagram was sionthe method of chromatographic fingerprint diagram established in this project can serve as an experimental basis for quality control of jspds.

　　key words：jianshenjiedu peritoneal dialysis solution(jspds(ⅲ))； radix astragali； high performanc liquid chromatography； chromatographic fingerprint diagram

　　健肾解毒腹膜透析液（ⅲ）［jianshenjiedu peritoneal dialysis solution，jspds(ⅲ)］是由黄芪、丹参、大黄等中药有效部位组成的、用于治疗慢性肾功能衰竭的新型中药复方制剂。中药黄芪性温味甘，归肺、脾经，具有补气固表，利尿托毒等功能。中医临床上可用于治疗气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，慢性肾炎蛋白尿等。黄芪有效部位为jspds(ⅲ)君药，故选择黄芪甲苷作为指标成分，本研究根据现代色谱分析技术水平，建立jspds（ⅲ）成品的rphplc—elsd法指纹图谱分析方法，更加全面地评价其质量［1］。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器agilentl100高效液相色谱仪，alhech2000型蒸发光散射检测器，agilent chemsation for lc and lc／ms systems色谱工作站；bp一211d型电子分析天平(德国satoritxs公司)。

　　1.2 试药

　　1.2.1 健肾解毒腹膜透析液（ⅲ）的制备先将黄芪、丹参、大黄3种药材分别用煎煮、柱层析、有机溶剂提取等提取分离方法制备成各自的中间体，再将3种药材中间体按一定比例加入其他药物制备成健肾解毒腹膜透析液制剂［2］。

　　1.2.2 其他试药黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0781—200311)；乙腈(色谱纯，merck公司)；重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件li chro cart hplc-kartusche rp-18e色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)；流动相 a-乙腈，b-水，梯度洗脱（见表1）。流速 0.80 ml/min，进样量20 μl，柱温 25℃，elsd参数漂移管温度106℃， 氮气流速3.00 ml/min，理论板数以黄芪甲苷计算不低于4 000。表1 乙腈－水梯度洗脱（略）

　　2.2 参照物峰的选择与参照物溶液的制备因黄芪甲苷为有效部位指标性成分，且在hplc指纹图谱中黄芪甲苷的色谱峰面积较大、稳定，故选择黄芪甲苷的色谱峰为参照物峰［3］，计算其它色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

　　精密称取黄芪甲苷对照品10.03 mg,置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每毫升含黄芪甲苷1.003 mg的参照物溶液。

　　2.3 供试品溶液和阴性对照溶液的制备与测定按处方精密称取jspds(ⅲ)冻干粉适量，加水适量溶解并稀释，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液(2 g／l)，同法制得阴性对照溶液。 分别吸取供试品溶液、参照物溶液及阴性对照溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，记录60 min色谱图，阴性对照溶液的色谱图无干扰。

　　2.4 方法学考察

　　2.4.1 精密度实验 取jspds（ⅲ）同一供试品溶液，连续注入高效液相色谱仪5次，考察各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的一致性。实验结果表明，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％ ，精密度良好，符合指纹图谱规定要求［4］。

　　2.4.2 重复性实验取同一批jspds（ⅲ）分别制备供试品溶液6份，分别注入高效液相色谱仪，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性。实验结果表明，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％，重复性良好，符合指纹图谱规定要求。

　　2.4.3 稳定性实验取同一jspds（ⅲ）供试品溶液，分别在0，2，4，8，16 h时，室温(25℃)下检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性。实验结果表明，jspds(ⅲ)供试品溶液16 h内，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％ ，稳定性良好，符合指纹图谱规定要求。

　　2.5 10批jspds(ⅲ)试品指纹图谱根据10批jspds（ⅲ）试品的检测结果，比较其特征色谱图(见图1)，确定各批jspds(ⅲ)共有的、相对稳定的7个色谱峰为共有峰，10批试品相对保留时间（见表2）。

　　共考察10批jspds（ⅲ）成品指纹图谱，选择7个色谱峰为共有峰，其保留时间（峰号）分别约为1.484 min(1)，4.420 min（2），12.154 min（3），12.983 min（4），15.353 min（5），16.847 min（6），27.719 min（7，s）。其中，黄芪甲苷为7号峰，为s峰。

　　测试条件下，l0批jspds（ⅲ）供试品检测结果表明：主要共有峰面积比值为2∶3∶4∶5∶6∶7(s)=（0.210～0.39）∶（0.272～0.504）∶（0.137～0.255）∶（0.130～0.242）∶（0.0826～0.153）∶（1.000）。

　　共有峰面积占总峰面积比值(见表3)均大于95％，非共有峰面积占总峰面积比值均小于5％ ，符合指纹图谱规定要求［5］。

　　应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件a版(中国药典委员会推荐)分析评价相似度。共测定l0批jspds（ⅲ）的rphplc—elsd指纹图谱，相似度均大于0.900，符合指纹图谱要求(0.900～1.000)。表2 10批jspds(ⅲ)指纹图谱评价结果(相对保留时间)（略）表3 10批jspds(ⅲ)主要共有峰峰面积比值（略）

　　3 讨论

　　黄芪药材及制剂的指纹图谱研究已有少量相关报道［6～8］，然而jspds(ⅲ)是一种新制剂，除了黄芪外还包含其他有效成分，以往文献报道的色谱条件并不适用于jspds(ⅲ)［9～14］。本次研究采用的方法适用于jspds(ⅲ)，可有效地控制其质量，为研制安全有效的jspds(ⅲ)提供了新的实验基础。

　　指纹图谱相似度的评价方法有欧氏距离法、绝对距离法、minowsky距离法、夹角余弦法、相关系数法以及峰匹配度法等6种［5，15～16］，相比较而言，峰匹配法能较灵敏地检测小峰个数波动，欧氏距离测定法则具有较好的综合评价能力，夹角余弦法对于检测指纹图谱间谱峰比例关系的变动较为适宜，因此，更适于分析评价不同批次间药品质量的稳定性。故在建立指纹图谱分析方法中选择夹角余弦法评价jspds（ⅲ）药材、中间体和成品的相似度。

　　在建立jspds（ⅲ）成品的指纹图谱实验中，应用了梯度洗脱的方法，较好地使每个色谱峰得到基本分离。因elsd漂移管温度和n2流速等参数不能随着流动相比例的变化设定，故应用hplc-elsd法进行梯度洗脱，与hplc-dad法相比有局限性，流动相比例变化不能太大，参数的设定一般以梯度洗脱中极性较大的流动相为主要参考。实验表明，在指纹图谱研究中，由于中药成分复杂，使用等度洗脱系统往往难以得到反映全组分指纹特征的hplc色谱图。在对jspds(ⅲ)指纹图谱研究中，采用了梯度洗脱方法，使色谱峰得到较好的分离。找到合适的梯度洗脱系统是jspds(ⅲ)指纹图谱方法建立的关键。

　　致谢：在本课题完成过程中，得到傅晓晴教授、陈鼎雄主任药师的悉心指导及大力支持，在此表示衷心的感谢！

【参考文献】
　［1］任德权.中药指纹图谱质控技术的意义与作用［j］.中药新药与临床药理，2002，12（3）：135.

　　［2］陈 丹,刘文英 ,王二丽. 健肾解毒腹膜透析液(ⅲ)中总皂苷的含量测定［j］.中医药学刊,2005,23(1):79.

　　［3］林奇泗,陈 丹,王二丽.健肾解毒腹膜透析液hplc—elsd定量方法的建立［j］.陕西中医学院学报, 2008,31(4):77.

　　［4］国家药品监督管理局中药注射液指纹图谱研究的技术要求［暂行］［j］.中国药品标准，2000，1（4）：3.

　　［5］王 玺，王文宇，张克荣,等. 中药hplc指纹图谱相似性研究的探讨［j］. 沈阳药科大学学报,2003，20(5):360.

　　［6］胡芳弟,赵健雄,封士兰，等.黄芪的高效液相色谱指纹图谱及主成分的含量测定［j］.中药材,2004，27（11）：831.

　　［7］徐 青，王加宁，肖红斌，等.黄芪药材的指纹图谱的研究方法的建立［j］.分析测试学报,2002，21（2）：89.

　　［8］曾令杰，陈 矛，王德勤. hplc指纹图谱的中成药质量控制模式研究［j］. 中成药,2003，25（5）: 347.

　　［9］林奇泗,陈 丹,王二丽.健肾解毒腹膜透析液指纹图谱的建立［j］.徐州医学院学报,2008,28(5):319.

　　［10］王 雁,毕开顺.三七hplc指纹图谱的建立［j］.中国中药杂志,2003,28(4)：316.

　　［11］高增平,陆蕴如,王宝华. 三七药材指纹图谱研究［j］. 中国实验方剂学杂志,2003,9(1)：11.

　　［12］王 颖,陈新发,盛龙生. 三七注射液指纹图谱的lc／ms测定［j］. 中药新药与临床药理,2001,12(3)：160.

　　［13］夏 泉,李绍平,黄赵刚，等. 三七总皂苷注射液hplc指纹图谱的比较分析［j］. 中成药,2004,26(5)：345.

　　［14］高增平,陆蕴如,孙 伟. 血栓通注射液指纹图谱研究［j］. 中国实验方剂学杂志,2002,8(6)：1.

　　［15］孟庆华，刘永锁，王健松，等. 色谱指纹图谱相似度的新算法及其应用［j］. 中成药,2003,25(1): 4.

　　［16］程冀宇,陈闽军,吴永江. 化学指纹图谱的相似性测度及其评价方法［j］.化学学报,2002,60(11)：2017.

【摘要】 目的运用中医药理论和现代色谱分析技术，研究建立健肾解毒腹膜透析液(ⅲ) hplc-elsd指纹图谱分析方法，为安全有效地控制其质量提供实验依据。方法选择li chro cart hplc-kartusche rp-18e色谱柱，柱温25℃，以流动相 a=乙腈，b=水组成的梯度洗脱系统，流速0.8 ml／min，elsd参数漂移管温度106℃， 氮气流速3.00 ml/min。结果建立了健肾解毒腹膜透析液（ⅲ）的指纹图谱。结论所建立的健肾解毒腹膜透析液(ⅲ) hplc—elsd指纹图谱分析方法，可有效地控制其质量，为研制安全有效的健肾解毒腹膜透析液提供了新的实验基础。

【关键词】 健肾解毒腹膜透析液(jspds(ⅲ))； 黄芪； 高效液相色谱法； 指纹图谱

establishment of the chromatographic fingerprint of jianshenjiedu peritoneal dialysis solution
　　
　　wang erli, chen dan*, bao guorong, lin qisi

　　(department of pharmacology， zhangzhou medical vocational college, zhangzhou 363000, china; department of pharmacy，fujian college of traditional chinese medicine，fuzhou 350003, china)

　　abstract：objectiveto establish the chromatographic fingerprint diagram of jianshenjiedu peritoneal dialysis solution(jspds(ⅲ))under the theoretical guide of chinese traditional medicine．methodsgradient elution mode was applied in the chromatographic separation as its key procedure．the stationary phase used was lichro cart hplckartusche rp18e mobile phase a was acetonitrile，mobile pohase b was water．the flow rate was 0.8ml／min．the detection was madeby elsd．the column temperature was 25℃．resultsthe method of jspds(ⅲ) chromatographic fingerprint diagram was sionthe method of chromatographic fingerprint diagram established in this project can serve as an experimental basis for quality control of jspds.

　　key words：jianshenjiedu peritoneal dialysis solution(jspds(ⅲ))； radix astragali； high performanc liquid chromatography； chromatographic fingerprint diagram

　　健肾解毒腹膜透析液（ⅲ）［jianshenjiedu peritoneal dialysis solution，jspds(ⅲ)］是由黄芪、丹参、大黄等中药有效部位组成的、用于治疗慢性肾功能衰竭的新型中药复方制剂。中药黄芪性温味甘，归肺、脾经，具有补气固表，利尿托毒等功能。中医临床上可用于治疗气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，慢性肾炎蛋白尿等。黄芪有效部位为jspds(ⅲ)君药，故选择黄芪甲苷作为指标成分，本研究根据现代色谱分析技术水平，建立jspds（ⅲ）成品的rphplc—elsd法指纹图谱分析方法，更加全面地评价其质量［1］。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器agilentl100高效液相色谱仪，alhech2000型蒸发光散射检测器，agilent chemsation for lc and lc／ms systems色谱工作站；bp一211d型电子分析天平(德国satoritxs公司)。

　　1.2 试药

　　1.2.1 健肾解毒腹膜透析液（ⅲ）的制备先将黄芪、丹参、大黄3种药材分别用煎煮、柱层析、有机溶剂提取等提取分离方法制备成各自的中间体，再将3种药材中间体按一定比例加入其他药物制备成健肾解毒腹膜透析液制剂［2］。

　　1.2.2 其他试药黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0781—200311)；乙腈(色谱纯，merck公司)；重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件li chro cart hplc-kartusche rp-18e色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)；流动相 a-乙腈，b-水，梯度洗脱（见表1）。流速 0.80 ml/min，进样量20 μl，柱温 25℃，elsd参数漂移管温度106℃， 氮气流速3.00 ml/min，理论板数以黄芪甲苷计算不低于4 000。表1 乙腈－水梯度洗脱（略）

　　2.2 参照物峰的选择与参照物溶液的制备因黄芪甲苷为有效部位指标性成分，且在hplc指纹图谱中黄芪甲苷的色谱峰面积较大、稳定，故选择黄芪甲苷的色谱峰为参照物峰［3］，计算其它色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

　　精密称取黄芪甲苷对照品10.03 mg,置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每毫升含黄芪甲苷1.003 mg的参照物溶液。

　　2.3 供试品溶液和阴性对照溶液的制备与测定按处方精密称取jspds(ⅲ)冻干粉适量，加水适量溶解并稀释，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液(2 g／l)，同法制得阴性对照溶液。 分别吸取供试品溶液、参照物溶液及阴性对照溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，记录60 min色谱图，阴性对照溶液的色谱图无干扰。

　　2.4 方法学考察

　　2.4.1 精密度实验 取jspds（ⅲ）同一供试品溶液，连续注入高效液相色谱仪5次，考察各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的一致性。实验结果表明，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％ ，精密度良好，符合指纹图谱规定要求［4］。

　　2.4.2 重复性实验取同一批jspds（ⅲ）分别制备供试品溶液6份，分别注入高效液相色谱仪，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性。实验结果表明，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％，重复性良好，符合指纹图谱规定要求。

　　2.4.3 稳定性实验取同一jspds（ⅲ）供试品溶液，分别在0，2，4，8，16 h时，室温(25℃)下检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性。实验结果表明，jspds(ⅲ)供试品溶液16 h内，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的rsd均小于3％ ，稳定性良好，符合指纹图谱规定要求。

　　2.5 10批jspds(ⅲ)试品指纹图谱根据10批jspds（ⅲ）试品的检测结果，比较其特征色谱图(见图1)，确定各批jspds(ⅲ)共有的、相对稳定的7个色谱峰为共有峰，10批试品相对保留时间（见表2）。

　　共考察10批jspds（ⅲ）成品指纹图谱，选择7个色谱峰为共有峰，其保留时间（峰号）分别约为1.484 min(1)，4.420 min（2），12.154 min（3），12.983 min（4），15.353 min（5），16.847 min（6），27.719 min（7，s）。其中，黄芪甲苷为7号峰，为s峰。

　　测试条件下，l0批jspds（ⅲ）供试品检测结果表明：主要共有峰面积比值为2∶3∶4∶5∶6∶7(s)=（0.210～0.39）∶（0.272～0.504）∶（0.137～0.255）∶（0.130～0.242）∶（0.0826～0.153）∶（1.000）。

　　共有峰面积占总峰面积比值(见表3)均大于95％，非共有峰面积占总峰面积比值均小于5％ ，符合指纹图谱规定要求［5］。

　　应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件a版(中国药典委员会推荐)分析评价相似度。共测定l0批jspds（ⅲ）的rphplc—elsd指纹图谱，相似度均大于0.900，符合指纹图谱要求(0.900～1.000)。表2 10批jspds(ⅲ)指纹图谱评价结果(相对保留时间)（略）表3 10批jspds(ⅲ)主要共有峰峰面积比值（略）

　　3 讨论

　　黄芪药材及制剂的指纹图谱研究已有少量相关报道［6～8］，然而jspds(ⅲ)是一种新制剂，除了黄芪外还包含其他有效成分，以往文献报道的色谱条件并不适用于jspds(ⅲ)［9～14］。本次研究采用的方法适用于jspds(ⅲ)，可有效地控制其质量，为研制安全有效的jspds(ⅲ)提供了新的实验基础。

　　指纹图谱相似度的评价方法有欧氏距离法、绝对距离法、minowsky距离法、夹角余弦法、相关系数法以及峰匹配度法等6种［5，15～16］，相比较而言，峰匹配法能较灵敏地检测小峰个数波动，欧氏距离测定法则具有较好的综合评价能力，夹角余弦法对于检测指纹图谱间谱峰比例关系的变动较为适宜，因此，更适于分析评价不同批次间药品质量的稳定性。故在建立指纹图谱分析方法中选择夹角余弦法评价jspds（ⅲ）药材、中间体和成品的相似度。

　　在建立jspds（ⅲ）成品的指纹图谱实验中，应用了梯度洗脱的方法，较好地使每个色谱峰得到基本分离。因elsd漂移管温度和n2流速等参数不能随着流动相比例的变化设定，故应用hplc-elsd法进行梯度洗脱，与hplc-dad法相比有局限性，流动相比例变化不能太大，参数的设定一般以梯度洗脱中极性较大的流动相为主要参考。实验表明，在指纹图谱研究中，由于中药成分复杂，使用等度洗脱系统往往难以得到反映全组分指纹特征的hplc色谱图。在对jspds(ⅲ)指纹图谱研究中，采用了梯度洗脱方法，使色谱峰得到较好的分离。找到合适的梯度洗脱系统是jspds(ⅲ)指纹图谱方法建立的关键。

　　致谢：在本课题完成过程中，得到傅晓晴教授、陈鼎雄主任药师的悉心指导及大力支持，在此表示衷心的感谢！

【参考文献】
　［1］任德权.中药指纹图谱质控技术的意义与作用［j］.中药新药与临床药理，2002，12（3）：135.

　　［2］陈 丹,刘文英 ,王二丽. 健肾解毒腹膜透析液(ⅲ)中总皂苷的含量测定［j］.中医药学刊,2005,23(1):79.

　　［3］林奇泗,陈 丹,王二丽.健肾解毒腹膜透析液hplc—elsd定量方法的建立［j］.陕西中医学院学报, 2008,31(4):77.

　　［4］国家药品监督管理局中药注射液指纹图谱研究的技术要求［暂行］［j］.中国药品标准，2000，1（4）：3.

　　［5］王 玺，王文宇，张克荣,等. 中药hplc指纹图谱相似性研究的探讨［j］. 沈阳药科大学学报,2003，20(5):360.

　　［6］胡芳弟,赵健雄,封士兰，等.黄芪的高效液相色谱指纹图谱及主成分的含量测定［j］.中药材,2004，27（11）：831.

　　［7］徐 青，王加宁，肖红斌，等.黄芪药材的指纹图谱的研究方法的建立［j］.分析测试学报,2002，21（2）：89.

　　［8］曾令杰，陈 矛，王德勤. hplc指纹图谱的中成药质量控制模式研究［j］. 中成药,2003，25（5）: 347.

　　［9］林奇泗,陈 丹,王二丽.健肾解毒腹膜透析液指纹图谱的建立［j］.徐州医学院学报,2008,28(5):319.

　　［10］王 雁,毕开顺.三七hplc指纹图谱的建立［j］.中国中药杂志,2003,28(4)：316.

　　［11］高增平,陆蕴如,王宝华. 三七药材指纹图谱研究［j］. 中国实验方剂学杂志,2003,9(1)：11.

　　［12］王 颖,陈新发,盛龙生. 三七注射液指纹图谱的lc／ms测定［j］. 中药新药与临床药理,2001,12(3)：160.

　　［13］夏 泉,李绍平,黄赵刚，等. 三七总皂苷注射液hplc指纹图谱的比较分析［j］. 中成药,2004,26(5)：345.

　　［14］高增平,陆蕴如,孙 伟. 血栓通注射液指纹图谱研究［j］. 中国实验方剂学杂志,2002,8(6)：1.

　　［15］孟庆华，刘永锁，王健松，等. 色谱指纹图谱相似度的新算法及其应用［j］. 中成药,2003,25(1): 4.

　　［16］程冀宇,陈闽军,吴永江. 化学指纹图谱的相似性测度及其评价方法［j］.化学学报,2002,60(11)：2017.

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