【摘要】 目的观察秦艽总苷对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法mtt法检测秦艽总苷对人肝癌smmc-7721细胞生长的影响，流式细胞仪分析细胞凋亡率，瑞-姬氏染色观察细胞形态变化。结果秦艽总苷浓度为125，250， 500，1 000 μg/ml时，smmc-7721细胞的生长受到不同程度的抑制，且有时间和浓度依赖性;流式细胞术检测显示一定浓度的秦艽总苷可诱导smmc-7721细胞凋亡；倒置显微镜下smmc-7721细胞出现细胞凋亡的形态学改变。结论一定浓度的秦艽总苷对人肝癌细胞smmc-7721有抑制增殖和诱导凋亡的作用。
【关键词】 秦艽总苷；smmc-7721细胞；凋亡
中药秦艽味苦、辛，性平,具有清热、除湿、止痛的功效。关于秦艽药理学方面的研究证明,秦艽具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热、镇痛、免疫调节、保肝利胆等作用［1～9］。本研究以人肝癌细胞smmc-7721为研究对象，观察秦艽总苷对smmc-7721细胞的生长、细胞凋亡以及形态方面的影响，并以龙胆苦苷（>99%）作对照，比较相同浓度下对细胞作用的强弱。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 样品
秦艽总苷(艽龙胶囊)购自西安正大制药有限公司，龙胆苦苷标准品（>99%）购自上海华美工程公司。秦艽总苷用pbs溶解，20 μl过滤除菌，获1 g/ml储备液备用；龙胆苦苷用pbs溶解，20 μl过滤除菌，获104 μmol/l备用。
1.2 细胞系
smmc-7721细胞由南京中医药大学药理实验室提供。
1.3 试剂
胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，dmem培养液购自gibco公司，annexinv-fitc凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司，瑞-姬氏染液购自南京建成生物工程研究所。
1.4 仪器
细胞培养箱（ht151）购自上海力申科技有限公司，酶联免疫检测仪（sunrise）购自瑞士tecan公司，bd facscalibur流式细胞仪购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司。
2 方法
2.1 smmc-7721细胞培养
smmc-7721细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的dmem培养液，在37℃、5%co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞达80%～90%融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存细胞，实验时取指数生长期细胞。
2.2 细胞生长情况测定
细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用dmem培养液调细胞浓度为104个/l，每孔90 μl接种于96孔培养板内，分别加入10 μl 31.25， 62.5，125， 250， 500，1 000 μg/ml 的秦艽总苷，设6个复孔。并设立加104 μmol/l的龙胆苦苷对照组，加pbs的阴性对照组。培养24， 48， 72 h后加入5 mg/ml的mtt 20 μl继续培养4h，吸弃孔内培养液后每孔加入dmso 100 μl,使结晶充分溶解，酶标仪测其吸光度，波长550 nm。细胞生长抑制率（%）=（1-药物组吸光度/阴性对照组吸光度）×100%。
2.3 流式细胞仪测定
smmc-7721细胞凋亡情况用上述方法将细胞浓度调为105/l，每孔2 700 μl接种于6孔培养板内，分别加入300 μl的1， 5，10 mg/ml的秦艽总苷，设立3个复孔，并设立加104 μmol/l的龙胆苦苷为阳性对照组，加pbs为阴性对照组。继续培养48 h后，吸弃孔内培养液，收集细胞，离心，用pbs洗2次，加入500 μl的binding buffer悬浮细胞，加入5 μl annexin v-fitc混匀后，加入5 μl propidium iodide, 混匀,室温、避光、反应15 min后在上机检测细胞凋亡。
2.4 瑞-姬氏染色观察
细胞形态将盖玻片置于六孔板内，分别2 700 μl 106个/l的细胞悬液，加入1 000 μg/ml 的秦艽总苷300 μl, 并设立阴性对照组，继续培养48 h，吸弃孔内培养液，取出盖玻片平置于染色架上，滴加复合染液3～4滴，使其迅速盖满盖玻片，染色1 min后滴加缓冲液6～10滴，轻摇玻片，使其充分混合，5～7 min后自来水冲去染液，待干后于光学显微镜检查。
2.5 统计学处理
采用spss 15.0进行数据处理。
3 结果
3.1 秦艽总苷对smmc-7721细胞增殖的影响
结果见表1。由表1可见，秦艽总苷浓度为31.25，62.5 μg/ml时无抑制作用，而在125， 250， 500，1 000 μg/ml时有一定的抑制作用，其抑制率随浓度和时间而呈上升趋势（p<0.05），与同浓度的龙胆苦苷相比秦艽总苷抑制率较大。
表1 秦艽总苷对smmc-7721细胞增殖的影响（略）
3.2 不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响
结果见表2及图1～2。随着秦艽总苷浓度的增加，早期凋亡期细胞比率增加。表2 不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响（略）
3.3 细胞形态学观察
瑞-姬氏染色显示，阴性对照组smmc-7721细胞增殖活跃，分裂期细胞多见，细胞核呈类圆形，边界清，染色质均匀分布呈浅蓝色，核仁明显（2～3）个，细胞有伪足使细胞形态不规则，细胞密度高（见图3）。秦艽总苷作用后48h后，smmc-7721细胞形态发生明显变化，细胞密度降低并出现凋亡细胞，细胞体积变小，细胞核固缩，核仁消失，核染色呈紫蓝色。见图4。
4 讨论
肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，多发病。临床治疗肿瘤西医一般采用手术、放疗、化疗三大疗法，疗效快捷，确有根治效果，但往往有明显的损伤和毒副作用。因此，寻找有效且无损伤和毒副作用的抗癌药物与方法，彻底攻克癌症，是世界医学界重要的研究课题。通过长期的研究和探索，中医药治疗肿瘤已取得了很大进展，而且中药材自然资源丰富、品种繁多、毒副作用低、价格低廉、为抗肿瘤较为理想的药物。许多国内外学者从天然药物筛选到有效单体提取做了大量研究，显示了中医药治疗肿瘤的独特优势。中医学认为,热毒是肿瘤发生、发展的一个重要因素。实验研究提示清热解毒中药通过抑制细胞增殖、诱导凋亡、分化及逆转、调节机体免疫水平、调控细胞信号通路及传导、抗突变、抑制血管生成和抗多药耐药等多种途径发挥抗肿瘤作用［10］。
细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生发展的关键，多种化疗药物均可引起细胞的凋亡［11］。本实验流式细胞仪检测显示，一定浓度的秦艽总苷和龙胆苦苷作用后，凋亡前期细胞率都明显增高，并显示出在同浓度下秦艽总苷处理组抑制率大于龙胆苦苷处理组；发现秦艽总苷作用于smmc-7721细胞后光镜下可观察到凋亡细胞形态学变化，证明秦艽总苷对人肝癌smmc-7721细胞抑制作用的机理与诱导癌细胞凋亡有关。
本研究观察秦艽总苷在体外对人肝癌smmc-7721细胞增殖的影响，结果显示当秦艽总苷浓度为125 μg/ml时即有抑制作用,随着秦艽总苷浓度的增加和时间的延长其抑制作用更加明显，表明秦艽总苷对smmc-7721细胞生长的作用与药物浓度和时间有密切关系；与同浓度的龙胆苦苷相比较，秦艽总苷抑制率较大，表明秦艽总苷对smmc-7721细胞的抑制作用比单体龙胆苦苷更强。
现代药理学研究证明，秦艽的主要成分龙胆苦苷（gps）能抑制多种炎症介质包括组胺、5-ht、ltb4、il-1、tnf-α、pg、血栓素血小板活性因子、氧自由基等的释放，对人肝癌细胞具有杀伤效应［12］。然而，氧自由基在细胞增殖、分化、逆转过程中起着重要作用。因此，gps及秦艽总苷抑制肝癌细胞的机理有待进一步深入研究。
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