作者:田吉,李翅翔,何兵,肖顺汉
【摘要】 目的建立楤木及其提取物中齐墩果酸的含量测定方法。方法采用 高效液相色谱(hplc)法,色谱柱为kromasil c18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(95∶5),检测波长210 nm,柱温30℃;流速1.0 ml·min-1;进样量10μl。结果齐墩果酸在0.502~4.016μg 范围内与峰面积具有良好的线性关系(r=0.999 9),平均回收率96.38 %,rsd为1.17%。结论该方法灵敏、准确,可用于楤木及其提取物的质量控制。
【关键词】 楤木; 提取物; 齐墩果酸; 含量测定; 高效液相色谱法
abstract:objectiveto establish a method for the determination of oleanolic acid in root bark of aralia and its extracts.methodsa kromasil c18 column(250mm×4.6mm,5μm) with mobile phase consisting of methanol-water (95∶5) was adopted,and the detection wavelength was set at 210 nm. the column temperature was 30℃. the flow rate was 1.0 ml·min-1,and the sample volume was 10μl.resultsthe calibration curve showed good linearity over the range of 0.502~4.016μg(r=0.999 9).the average recovery was 96.38 % with rsd 1.17%.conclusionthe method is sensitive,accurate,and is suitable for the quality control of root bark of aralia and its extracts.
key words:root bark of aralia ; extracts; oleanolic acid; content determination; hplc
楤木,又称楤木白皮,为五加科楤木属植物楤木aralia chinensis l.的根皮,具有祛风湿,利小便,散淤血,消肿毒的功效[1]。全国各地以多种楤木属植物的根皮作楤木入药,常见的有楤木、太白楤木、辽东楤木、黄毛楤木等种。楤木属植物的主要有效成分为楤木皂苷,苷元为齐墩果酸。楤木皂苷具有适应原样作用,以及中枢神经抑制、强心、降血脂、降血糖和降血压、抗癌等多种药理作用[2,3]。但目前国家尚无楤木皂苷的法定对照品,为控制质量,本实验采用高效液相色谱法,以苷元齐墩果酸为指标,测定了楤木药材及其提取物楤木总皂苷的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
戴安高效液相色谱仪(p680a四元低压梯度泵,pda-100二极管阵列检测器,tcc-100柱温箱,chromeleon色谱工作站);瑞士precisa电子天平(xr 205sm-dr)。
1.2 试药
辽东楤木,购至安徽亳州药材市场,产地辽宁,楤木,采至四川省泸州市纳溪区龙车乡,经泸州医学院生药教研室鉴定分别为辽东楤木aralia elata (miq.)的及楤木aralia chinensis l.的根皮。楤木总皂苷,由泸州医学院药物研究所自制。齐墩果酸对照品(110781-200512),中国药品生物制品检定所提供,经hplc峰面积归一化法计算纯度在98%以上。甲醇为色谱纯,水为重蒸馏水,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为dikma kromasil c18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-水(95∶5);检测波长为210 nm;柱温为30℃;流速为1.0 ml·min-1;进样量10 μl。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取齐墩果酸对照品5 mg,加甲醇25 ml制成0.2 mg·ml-1的对照品溶液(实际0.200 8 mg·ml-1)。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 楤木药材供试品溶液的制备
精密称取药材细粉0.2 g,加入25 ml甲醇,回流提取4 h,过滤,少量甲醇洗涤,合并滤液,水浴挥去甲醇,加20 ml10%稀硫酸,水浴回流4 h,氯仿60 ml分5次萃取,合并萃取液,10 ml水洗后水浴蒸干,加甲醇溶解并定容到10 ml。
2.3.2 楤木提取物供试品溶液的制备
精密称取总皂苷0.2 g,加入20 ml 10%稀硫酸,水浴回流4 h,氯仿60 ml分5次萃取,合并萃取液,水浴蒸干,加入甲醇定容到25 ml,精密量取1 ml,用甲醇定容至10 ml。
2.4 系统适应性实验分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各10 μl,注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录色谱图,结果见图1~4。在试验条件下,齐墩果酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5,理论塔板数以齐墩果酸峰计均大于10 000,溶剂无干扰。
2.5 线性关系考察
精密吸取齐墩果酸对照品溶液 (0.200 8 mg·ml-1) 2.5,5,7.5,10,15,20 μl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积a对进样量c(μg)进行回归,回归方程为:a=8.135 4c-0.012 2,r=0.999 9。齐墩果酸在进样量0.502~4.016 μg范围内,峰面积与进样量有良好的线性关系。
2.6 精密度实验分别取“2.2”项下对照品溶液10 μl,按上述色谱条件连续进样6次,记录齐墩果酸的峰面积,rsd为0.45%。表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性实验取“2.3.1”项下供试品溶液,于制备后0,4,8,12,24,36 h进样10 μl,记录齐墩果酸的峰面积,其rsd为1.95%,表明供试品溶液在36 h内较稳定。
2.8 重复性实验取同一批药材(批号:070801),按“2.3.1”项下方法分别制得6份供试品溶液,进样测定,记录齐墩果酸的峰面积并计算含量,rsd为1.29%。表明上述方法重复性良好。
2.9 加样回收实验精密称取已知含量(1.69%)的楤木药材(批号:070801)9份,每份0.1 g,分成3组,每组3份,分别精密添加齐墩果酸对照品储备液(0.675 mg·ml-1)2,2.5,3 ml,按照“2.3.1”项下方法制备供试品溶,按上述色谱条件测定,并计算平均加样回收率。结果见表1。表1 加样回收实验结果(略)
实验结果表明,上述方法具有良好的回收率。
2.10 样品测定 分别精密量取齐墩果酸对照品溶液和各供试品溶液10 μl,照上述色谱条件测定,并计算齐墩果酸的含量。结果见表2。表2 楤木及其提取物中齐墩果酸含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 检测波长的确定
采用二级管阵列检测器在190~500 nm波长范围对对照品及各样品中的齐墩果酸峰进行光谱扫描,其最大吸收波长均为201 nm,但由于流动相在短波长处有末端吸收,为了减少干扰,经不同波长的色谱图比较,选择210 nm为检测波长,峰形好,干扰小。
3.2 前处理方法的选择
参考文献资料,对药材的前处理采取了先水解后氯仿萃取,以及先甲醇提取,水解后氯仿萃取两种方法,进行对比,结果前者测得的齐墩果酸含量为后者的80%,所以,最后选择了甲醇提取+水解+氯仿萃取的方法。
3.3 提取方法的选择
实验对药材的甲醇提取方法也进行了比较,考察了超声一次,超声两次,回流提取4 h,索氏提取4 h 四种方法,结果,以回流提取得到的齐墩果酸含量最高,最终选择甲醇回流4h的药材提取方法。
3.4 辽东楤木、楤木图谱比较
两种药材的齐墩果酸含量差别不大,但在hplc图谱中,楤木在齐墩果酸峰前面有明显的3个小峰,而辽东楤木仅有1个小峰,且含量极低,能否作为区别二者的依据之一,尚需加大样本量,作进一步考察。
【参考文献】
[1]湖南省卫生厅.湖南省中药材标准[s].长沙:湖南省科学技术出版社,1993:339.
[2]许旭东,杨峻山,朱兆仪.楤木属植物三萜皂甙研究进展[j].药学学报,1997,32 (9):711.
[3]王忠壮,万鲲,胡晋红.楤木属药用植物的药理活性研究[j].中国药学杂志,2002,37(2):86
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