【摘要】 实验发现激动素对固定于碳纳米管/nafion复合膜修饰电极上的吡啶钌弱电化学发光信号有强的增敏作用，基于此建立了一种高灵敏的电化学发光直接测定激动素的新方法。在优化的实验条件下，本方法测定激动素的线性范围为5.0×10－8～4.0×10－5g/l；检出限为2.0×10－8 g/l；相对标准偏差（rsd）为5.8% (n=11, c=5×10－6 g/l)；方法操作简单方便，灵敏度高。
【关键词】 激动素 电化学发光 修饰电极 吡啶钌
1 引言
植物激素是一类对植物生长有显著作用的微量有机分子。它们虽然分子量较小，结构较简单，但其生理效应却复杂多样。从影响细胞的分裂、伸长、分化到影响植物的发芽、生根、开花、结果、性别决定、休眠和脱落等[1]。所以，植物激素对植物的生长发育有重要的调控作用。目前植物激素主要包括九类[2]，分别是生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯、油菜素内酯、茉莉酸类、水杨酸及多胺类。这些激素各自有着独特的生理效应，或协调植物的生长发育，或调控植物应对各种逆境，而且九类激素还可以通过增效或拮抗的方式组成复杂的调控体系，使得对于植物生长发育或者应对外界环境的调控机制更加复杂和精细。激动素(又叫动力精)，是第一个被发现的细胞分裂素[3]。在20世纪50年代初期，很多科学家开始从生物组织中获取化学物质并研究其各种性质。1954年，米勒发现青鱼精液dna中有一种微量物质，可以促进细胞浆的移动[4]，这种物质被称为激动素。1955年，人们确定这种物质为6呋喃甲基腺嘌呤(分子式为c10h9n5o)。尽管激动素不是一种天然的细胞分裂素，但后来人们发现它和天然的细胞分裂素有类似的结构[5]，即在c6位置都有一个取代的嘌呤环，改变该结构可以减弱或消除其细胞动力学活性。激动素的主要作用是促进细胞分裂，同时 还具有延缓离体叶片衰老、诱导花芽分化和增加气孔开度等作用[1,6]。此外，激动素对离体小麦叶片中蛋白质含量的下降有延缓作用[7]；对菊花的花期具有延迟作用[8]；对鼠的实验表明，它具有逆转肝纤维化的作用[9]。由此可见，激动素在农业及生物研究方面具有广阔的应用前景。目前，已报道的测定激动素的方法主要有离子交换法[10]、高效液相色谱法、气相色谱质谱法[1１]、荧光[1２]、电化学[1３～１５]等方法。这些方法存在一些不足，如仪器昂贵、操作复杂、灵敏度较低等。
电化学发光(ecl)是指通过电化学的方法在电极表面产生一些特殊的物质，这些物质之间或与体系中其它组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态产生发光现象，是电化学与化学发光方法相结合的产物。用光电倍增管等光学仪器测量电化学发光过程中发光光谱和强度，从而对痕量物质进行分析 [1６]。该分析方法具有灵敏度高、线性范围宽、发光信号易于检测、易于控制和装置简单等特点。吡啶钌[ru(bpy)3]2+是发光效率较高的电化学发光活性物质，近年来它被广泛应用于有机酸，氨基酸和药物的测定[１７]。但由于吡啶钌用于溶液相电化学发光体系时，昂贵试剂吡啶钌的不断消耗带来成本高、环境污染和实验装置复杂等问题，使它的应用受到限制。基于电化学发光反应中[ru(bpy)3]2+在电极表面循环使用的特点，把[ru(bpy)3]2+固定在电极表面不仅可以克服上述问题，还可以提高电化学发光强度[1８]。 因此，人们提出了许多方法和材料，以将吡啶钌固定在电极表面。在所有的固定化方法中，nafion 是最常用的一种材料，基于nafion的离子交换特性，[ru(bpy)3]2+ 可以通过离子交换作用被固定于纯的nafion膜中[１９]。而将[ru(bpy)3]2+固定在碳纳米管/nafion复合物膜修饰电极表面可以使[ru(bpy)3]2+在nafion膜上的电化学发光特性有较大的改善[2０]。在这种固定化方法中，nafion充当膜材料、离子交换剂和碳纳米管的溶剂；而碳纳米管在nafion膜中起到吸附吡啶钌、改善膜结构及作为膜中的导电通道等作用。实验发现，激动素对碳纳米管/nafion[ru(bpy)3]2+修饰电极的电化学发光信号有强的增敏作用，基于此建立了一种高灵敏度测定激动素的电化学发光新方法。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
rec100型电化学分析工作站，rfl1型超微弱化学发光/生物发光检测仪，iffsa型多功能化学发光检测器(以上仪器均为西安瑞迈分析仪器有限公司生产)；采用三电极体系：碳纳米管/nafion修饰的石墨电极为工作电极，缠绕铂丝为对电极，ag/agcl电极作参比电极。
1.0 g/l的激动素储备液：称取激动素(北京鼎国生物技术有限公司)25 mg，用0.1mol/l naoh溶解并用二次蒸馏水定容至25 mｌ棕色容量瓶中，于冰箱中4 ℃避光保存；吡啶钌(sigma 公司)储备溶液（浓度约为1.0×10－3mol/l）： 量取适量吡啶钌，用二次蒸馏水溶解后，储于棕色瓶中避光保存；nafion(aldrich公司)，用乙醇稀释成5.0g/l备用；多壁碳纳米管(深圳纳米技术进出口有限责任公司)；水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯试剂。
2.２ 修饰电极的制备方法
将适量碳纳米管粉末超声分散在一定浓度的nafion溶液中，形成较稳定的悬浊液。移取10 μl上述悬浊液均匀滴涂在处理过的洗净石墨电极表面，在室温环境中放置电极至溶剂蒸发电极表面干燥，然后把该电极浸在1.0×10－4 mol/l吡啶钌溶液中约０．５ h，电极取出后用蒸馏水充分冲洗其表面，再在0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液中循环伏安扫描至电流稳定。
以上述准备好的修饰电极为工作电极进行相关电化学及电化学发光测试。
3 结果与讨论
3.1 吡啶钌的固定化
采用循环伏安法研究了固定在碳纳米管/nafion复合物膜修饰电极表面的吡啶钌的电化学行为。分别测定了裸石墨电极、纯nafion修饰电极和碳纳米管/nafion复合物膜修饰电极在含有1.0×10－4mol/l吡啶钌的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安行为。实验表明，吡啶钌在此３种电极上的循环伏安响应在形状上相似，这说明通过简单的复合物膜修饰电极浸入吡啶钌溶液中可以有效固定吡啶钌，并且固定在电极上的吡啶钌能保持其良好的电化学行为。但吡啶钌在此３种电极上的氧化还原峰电流值明显不同，裸电极上的电流强度最小，纯nafion修饰电极次之，复合物修饰电极的电流强度最大。另外，固定吡啶钌的修饰电极在磷酸盐缓冲溶液中连续多次扫描对吡啶钌的氧化还原电流值没有明显的影响，此结果表明，此修饰电极具有较高的稳定性。这些结果和文献[1８]报道一致。
3.2 激动素的电化学行为
实验时，把裸石墨电极先后分别放入ph=9.0的磷酸盐缓冲溶液和含有一定浓度激动素的相同ph的磷酸盐缓冲溶液中，其循环伏安曲线如图１所示。结果说明，在不含激动素的缓冲溶液中得到的循环伏安图（a）上没有出现氧化还原峰，而含有激动素时所得的循环伏安图（b）在0.8～0.9 v位置处出现了明显的氧化峰。这表明在适当条件下激动素可以发生电化学氧化反应。同时，激动素的循环伏安图上只有氧化峰而无相应的还原峰，这说明激动素在石墨电极上的氧化反应为不可逆反应。此结果与文献[1５]报道类似。
3.3 激动素对吡啶钌氧化过程的催化作用
实验考察了激动素对固定于碳纳米管/nafion复合物膜中的吡啶钌电化学行为的催化作用。图2表示碳纳米管/nafion吡啶钌修饰电极分别在0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液（ph=9）中的循环伏安曲线（b）和在含有一定浓度激动素的0.1 mol/l磷酸盐缓冲溶液（ph=9）中的循环伏安曲线（a）。由图２可以看出：加入激动素后所得的循环伏安曲线与没加激动素所得曲线相比，吡啶钌的氧化峰电流大大增强，而还原峰电流明显减小。这表明吡啶钌对激动素的电化学氧化反应有催化作用。此现象与三丙胺对吡啶钌电化学行为的催化作用类似，由此可知激动素对吡啶钌的电化学发光增敏作用与三丙胺一致。
图１ 裸石墨电极分别在ph=9的磷酸盐缓冲溶液(a)和含有激动素的ph=9的磷酸盐缓冲溶液（b）中的循环伏安曲线.(扫速为0.05 v/s)（略）
fig.1 cyclic voltammograms of bare graphite electrode in phosphate buffer solution (ph=9) with (b) and without kinetin（a）(scan rate: 0.05 v/s)
图２ 碳纳米管/nafion吡啶钌修饰电极在含有激动素的磷酸盐缓冲溶液(a)和空白缓冲溶液(b)中的循环伏安曲线(ph=9)（略）
fig.２ cyclic voltammograms of carbon nanotube/nafionru(bpy)２＋3 in phosphate buffer solution with (a) and without kinetin (b)(ph=9)
3.4 激动素对吡啶钌电化学发光的增敏作用
实验分别测定了吡啶钌修饰电极在ph=9的磷酸盐缓冲溶液和含有5×10－6g/l激动素的相同磷酸盐缓冲溶液中的电化学发光信号。结果表明：激动素的加入使吡啶钌弱的电化学发光信号大大增强，而且随着激动素加入量的增加，电化学发光信号持续增大，说明了激动素对吡啶钌的弱电化学发光具有明显的增敏作用。
3.5 实验条件的优化
3.5.1 ph的选择 本实验以0.1 mol/l k2hpo4/nah2po4缓冲溶液为介质，分别用裸石墨电极和固定有吡啶钌的修饰石墨电极考查了在各种ph时激动素自身的电化学行为、激动素对吡啶钌的电化学反应的催化程度、以及对吡啶钌电化学发光增敏程度的影响。结果发现，在酸性介质中时，几乎看不出激动素的氧化峰，而在偏碱性介质中时，激动素有明显的氧化峰(图3)。这表明激动素在碱性介质中才易于被氧化，这与文献 [1５]报道一致。而此时吡啶钌的氧化峰电位也比酸性介质中的偏负，峰电流比酸性介质中大(图4)，即碱性介质中激动素对吡啶钌的催化效果也更好。
图３ 裸石墨电极在含相同浓度激动素的不同ph的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线（略）
fig.３ cyclic voltammograms of kinetin at bare graphite electrode in phosphate buffer solutions with different ph
扫速（scan rate）: 0.05 v/s。
实验中同时考察了不同ph的介质对激动素增敏的吡啶钌电化学发光信号的影响。结果发现，当ph较小时，随着ph的增大，增敏的电化学发光信号逐渐增大；当ph＝9.2时，激动素增敏的吡啶钌电化学发光信号达到最大；而随后随着ph的增大增敏的电化学信号开始下降(图5)。上述实验现象说明激动素对吡啶钌的电化学发光信号的增敏作用与其脱质子过程有关，这与文献[2１]报道的三丙胺和吲哚乙酸对吡啶钌电化学发光信号的增敏作用类似。本实验选择ph 9.2的0.1 mol/l k2hpo4/nah2po4缓冲溶液为介质。
图４ 碳纳米管/nafion吡啶钌修饰的石墨电极在含相同浓度激动素的不同ph的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线（略）
fig.４ cyclic voltammograms of kinetin at carbon nanotube/nafion ru(bpy)２＋3 modified graphite electrode in phosphate buffer solution with different ph
扫速（scan rate）: 0.05 v/s. 1. ph 9.1; 2. ph 8.7; 3. ph 6.7; 4. ph 4.7.
图５ 缓冲溶液质ph对电化学发光信噪比的影响(激动素: 5 ×10－6 g/l)（略）
fig.5 effect of ph on ecl signal/noise (kinetin: 5 ×10－6 g/l)
3.5.2 电解方式的选择 电化学发光的分析特性与激发信号的施加方式关系极为密切，其主要原因是电化学发光物质的产生速度在扩散层中的动态分布以及电化学反应与电化学发光反应相匹配的程度等步骤受电化学激发方式的调控[2２]。本实验主要考察了循环伏安、线性扫描、恒电位和阶跃脉冲等电解方式对激动素增敏的吡啶钌电化学发光行为，结果发现循环伏安法呈现出更好的电化学发光分析特性，稳定性好，且信噪比较高，所以实验中采用循环伏安作为最佳电化学激发信号。
3.5.3 扫描速度的选择及电极反应过程 将碳纳米管/nafion吡啶钌修饰电极放入含5.0×10－6 g/l激动素的磷酸盐缓冲溶液(ph=9.2)中，记录不同扫描速率时的循环伏安曲线(图6a)。实验发现，随着扫描速率的增加，吡啶钌峰电位正移，峰电流增大，并且峰电流与扫描速率的平方根成正比。这些实验结果表明：吡啶钌体系的电极反应为扩散控制过程。实验同时考察了扫描速率分别为0.25、0.16、0.1、0.05和0.025 ｖ/s时的电化学发光信号稳定性及信噪比(图6b)，发现扫描速率较小时电化学发光信号更稳定，信噪比也更高。所以本实验选择的扫描速率为0.05 ｖ/s。
图6 扫描速度对循环伏安曲线(a)和电化学发光信噪比(b)的影响（略）
fig.6 effect of scan rate on cyclic voltammograms at carbon nanotube/nafionru(bpy)2+3 (a) and signal/noise of ecl(b)
1. 0.09 v/s; 2. 0.04 v/s.
3.6 分析特性
在上述的最佳实验条件下，激动素增敏的吡啶钌电化学发光强度值与激动素的浓度在5.0×10－8～4.0×10－5 g/l范围内呈线性关系，线性回归方程为i=28+0.142c(10－8 g/l)，相关系数为0.9992，检出限为2.0×10－8 g/l，对5.0 ×10－6 g/l的激动素平行测定11次，相对标准偏差rsd为5.8 %。此结果说明：本实验所建立的电化学发光法测定激动素的方法具有高的灵敏度和稳定性。
3.7 干扰实验
在最佳实验条件下，考察了一些易与激动素共存的植物激素对激动素检测的干扰。以1.0×10－6g/l激动素溶液为空白溶液，与加有不同浓度的可能干扰物 (如赤霉素，吲哚乙酸等)的溶液进行对比测定，记录相应的发光信号和数据。如果加入某浓度干扰物质后，溶液的发光信号的改变程度大于或等于这种方法所允许的误差（5%），就认为所加入的物质已经产生了干扰。
相关数据如表1所示。实验表明：对于1.0×10－6 g/l激动素，10倍的吲哚乙酸，100倍的6苄基腺嘌和等量的赤霉素，均不干扰其测定。结果表明，所建立的方法测定激动素有较高的选择性。本方法灵敏度高，线性范围宽，操作简便，有望帮助进一步了解激动素等植物激素在植物体内各个部分的作用方式，进而更好地利用它们。
表1 干扰实验（略）
table 1 reference experiments
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