【摘要】 目的: 制备和鉴定抗his标签单克隆抗体（mab）, 初步建立检测和纯化带his标签融合蛋白的方法。方法: 用碳化二亚胺法合成his-tag完全抗原, 免疫balb/c小鼠, 采用杂交瘤技术进行细胞融合, 通过有限稀释法和间接elisa法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水, 用辛酸-硫酸铵法纯化, 并对纯化的mab进行特异性鉴定。结果: his-tag完全抗原偶联成功, 经细胞融合、 筛选及克隆化, 成功获得1株分泌his标签mab的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于 1∶106, 且此株mab与其他融合蛋白标签无交叉反应, 并在含his标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论: 成功制备了1株his标签mab, 为带his标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。
【关键词】 his标签 单克隆抗体 蛋白印迹
his-tag是由6个组氨酸(his-his-his-his-his-his)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化, his-tag 融合标签与其他标签相比有很多明显优势, 是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种［1］。利用 his标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。目前商品化his-tag的单克隆抗体(mab)种类不多, 且价格也十分昂贵。因此, 研制出 his-tag的mab, 在融合蛋白质的研究中具有非常广泛的应用前景。
1 材料和方法
1.1 材料 his六肽为西安蓝晶生物科技有限公司合成; 卵清白蛋白 (ova)、 牛血清白蛋白（bsa）、 兔抗小鼠 iga、 igg1、 igg2a、 igg2b、 igg3和igm抗体均购自sigma公司; hrp标记的羊抗鼠 igg由河南省生物工程技术研究中心提供; multiskan mk3酶标仪购自thermo公司; 3326型co2培养箱购自forma公司; 硝酸纤维素膜（nc膜）购自amersham公司; sds-page电泳仪购自bio-rad公司; balb/c纯系雄性小鼠（鼠龄6～8周, 体质量18～22 g）购自中国医学科学院动物研究所。
1.2 方法
1.2.1 人工抗原的合成 （1）免疫原的合成: 称取4.4 mg his-tag和5 mg ova溶于1 ml pb（0.05 mol/l, ph7.0）中, 充分溶解后, 将200 μl含有2.2 mg edc的pb溶液逐滴加入, 边滴入边混匀, 摇床100 r/min反应4 h, 4℃静置过夜, 用 0.01 mol/l, ph7.0 pbs透析 72 h, 存储于-20℃备用。（2）包被抗原的合成: 合成方法同免疫抗原的合成,载体蛋白为 bsa。
1.2.2 杂交瘤细胞株的建立 按本室常规方法免疫balb/c小鼠（20～30 μg /只）, 末次免疫后免疫小鼠血清效价达到 1∶10 000以上, 进行细胞融合, 并以间接elisa法筛选分泌抗 his-tag的阳性克隆。克隆化及腹水制备, 均按实验室常规方法进行。
1.2.3 mab特性鉴定 （1）效价测定: 以 bsa-his-tag（100 ng/孔）包被 elisa 板, 腹水从 1∶10 00 开始作10倍稀释。用间接 elisa法进行测定。（2）mab特异性鉴定: 用于抗体交叉反应性研究的为常用蛋白标签, c-myc、 多聚精氨酸、 flag、 钙调蛋白结合多肽、 β-actin、 谷胱甘肽s转移酶 (gst)、 葡萄球菌蛋白a(spa)、 麦芽糖结合蛋白、 硫氧化还原蛋白及 ig的 fc段, 用间接 elisa法测定。（3）抗体蛋白纯度测定: 抗体纯度测定采用 sds-page凝胶电泳分析。（4）ｉｇ类和亚类的鉴定: mab类型及亚类鉴定采用双向琼脂扩散试验［2］和用兔抗小鼠 iga、 igg1、 igg2a、 igg2b、 igg3和 igm酶标抗体的间接 elisa试验检测。
1.2.4 mab在检测带his-tag的融合蛋白中的初步应用 （1）酶标抗体的制备及活性测定: 酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法［3］。酶标抗体活性测定方法: 将包被抗原用包被液稀释成100 ng/孔包被96孔酶标板, 4℃过夜, 洗涤后分别加入梯度稀释的酶标抗体, 37℃温育 30 min, 洗涤; 加底物显色 20 min, 加终止液终止反应, 用酶标仪测吸光值。取a值为1.0左右时所对应的酶标抗体稀释倍数为其效价。（2）融合蛋白的检测: 采用蛋白印迹法对本基因工程实验室所纯化的带his-tag的基因工程蛋白进行检测［4］。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立及mab的特性鉴定 获得1株高亲和力、 高特异性杂交瘤细胞, 命名为 3a-3。此株细胞经过多次传代、 3次冻存及复苏, 杂交瘤细胞分泌抗体稳定。此株mab经检测, 腹水效价达到 2×10-6 ; mab经双向琼脂扩散试验和间接elisa法检测为: igg1; 各种融合蛋白标签与his-tag mab均无交叉反应性; sds-page电泳结果显示: 抗体纯度≥90%。
2.2 酶标抗体活性测定结果 由酶标仪（双波长450 nm和630 nm）检测a值, 测得酶标抗体活性达106。
2.3 带his-tag的融合蛋白检测结果 western blot结果显示, 制备的mab与带his-tag的融合蛋白有较强的特异性反应（图1）。
图1 带his-tag的融合蛋白检测结果（略）
a, c: sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳; b, d: western blot检测结果.
图1b和图1d分别是图1a和图1c的对应。其中11是不带his-tag的阴性对照, 其余所用的12种蛋白均为本实验室纯化的带his-tag的基因工程蛋白。其中1、 10中his6-tag与 rgs—相连, 位于基因工程蛋白n端, 2、 4、 5、 6、 8、 12、 13中his-tag位于基因工程蛋白内部, 3、 7、 9中his-tag位于基因工程蛋白c端。结果表明, 此株mab与河南省生物工程技术研究中心基因工程实验室所有带his-tag的基因工程蛋白反应均呈阳性, 与不带his-tag的基因工程蛋白无反应, 故此株mab可以用于检测带his-tag的基因工程融合蛋白。
3 讨论
融合标签根据其相对分子质量(mr)大小可以分为两大类: 大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段（his-tag等）。虽然有些作用机制尚不明确, 但已证实融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、 控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、 使体内生物事件可视化、 提高重组蛋白质的产量、 增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等［5］。标签融合蛋白所具有的上述优越性, 使之成为后基因组时代的重要研究工具, 而抗标签蛋白的mab也将成为研究相应融合蛋白的主要方法之一。 his6-tag由于其mr小, 单独不具备免疫原性, 故需将其连接到蛋白质大分子上, 从而借助大分子的t细胞表位, 刺激机体产生特异性抗体免疫应答。本试验采用碳化二亚胺法制备出了人工抗原。从免疫效果来看, 该方法合成的his6全抗原免疫原性较好, 能使机体产生较强的免疫应答, 小鼠抗血清效价（elisa）达到106以上。应用淋巴细胞杂交瘤技术获得的此株抗his6-tag的mab, 经鉴定具有效价高、 特异性强、 亲和力高等特点。在含his6-tag融合蛋白的鉴定中, his6-tag的mab与n端、 内部、 c端带his6-tag的基因工程蛋白均能发生反应, 取得预期效果。此将为后基因组时代大量涌现的新分子的结构和功能研究提供重要的工具, 有很高的实用价值。
目前纯化带his-tag的基因工程蛋白多采用固定化金属螯合层析, 利用过渡态金属离子与组氨酸侧链之间的相互作用进而分离目的蛋白。虽然用此法纯化his6-tag融合蛋白与其他标签融合蛋白相比有很多明显优势, 但此法也有其缺点: 在金属离子存在的情况下, 多聚组氨酸倾向于形成一种hem-like的结构, 这是一种疏水性的结构, 因而与某些蛋白质融合后, 有被埋藏在融合靶蛋白质内部的可能性［5］; 用咪唑洗脱会导致蛋白质的聚集。另外, 带his-tag的基因工程蛋白的纯化率还有一定上升空间, 能否通过his亲和层析柱在尽量低损失的情况下来有效填补空缺, 仍需要进一步的实验摸索。
【参考文献】
［1］ terpe k. overview of tag protein fusions: from molecular and bio-chemical fundamentals to commercial systems［j ］. appl microbiol bio-technol, 2003, 60: 523-533.
［2］ 余冰宾. 生物化学实验指导［m］. 北京: 清华大学出版社, 2004: 123-124.
［3］ 杨利国, 魏平华, 郭爱珍, 等. 酶免疫测定技术［m］. 南京: 南京大学出版社,1998: 189-210.
［4］ 萨姆布鲁克j, 费里奇ef, 曼尼阿蒂斯t(金冬雁, 等译). 分子克隆实验指南［m］. 2版. 北京: 科学出版社, 1992: 119-122.
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